LncRNA在高肺轉(zhuǎn)移與高淋巴道轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株中差異表達(dá)的研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，居惡性腫瘤死亡率的第二位。盡管近年來(lái)在肝癌診治上取得了較大的進(jìn)步，但肝癌的預(yù)后并沒(méi)有得到顯著的改善，轉(zhuǎn)移仍是影響肝癌預(yù)后的重要因素。肝癌的轉(zhuǎn)移途徑主要有血道轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移及鄰近器官的侵襲。轉(zhuǎn)移的一個(gè)主要特征就是癌細(xì)胞能夠定植在特異性的器官，臨床上肝癌肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率高于淋巴轉(zhuǎn)移。已有研究表明癌細(xì)胞的特異性器官轉(zhuǎn)

2、移與其內(nèi)在的基因特性相關(guān)。
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200nt的RNA分子。LncRNA在發(fā)現(xiàn)之處被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不具有生物學(xué)功能，然而現(xiàn)在漸受重視。研究指出lncRNA能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄模式、調(diào)節(jié)蛋白活性、作為小RNA的前體、改變RNA加工、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和保持其有序性等。同時(shí)，許多l(xiāng)ncRNA在疾病中發(fā)生錯(cuò)調(diào)，尤其是癌癥，這引起了研究者極大的興趣，然而

3、關(guān)于lncRNA在肝癌轉(zhuǎn)移中的報(bào)道甚少。本研究旨在分析lncRNA在人肝癌肺轉(zhuǎn)移及淋巴轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株中的表達(dá)譜，從而更好的了解lncRNA在肝癌特異性器官轉(zhuǎn)移中的作用。
　　研究方法:
　　采用體外單克隆培養(yǎng)和體內(nèi)篩選的方法，對(duì)現(xiàn)有高淋巴道轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌單克隆細(xì)胞株HCCLYM-H進(jìn)行單克隆優(yōu)化，獲得穩(wěn)定高淋巴轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株HCCLYM-H2，并建立相應(yīng)的裸鼠移植模型;應(yīng)用Arraystar人長(zhǎng)鏈非編碼芯片v2.0(該芯片

4、含有33045個(gè)lncRNA及30215個(gè)mRNA)檢測(cè)遺傳背景相同的高肺轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞株HCCLM3及高淋巴轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞株HCCLYM-H2中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達(dá)情況并使用安捷倫軟件11.0.1.1分析芯片數(shù)據(jù);同時(shí)構(gòu)建了lncRNA與mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò);將基因芯片的數(shù)據(jù)分析整理后，挑選6個(gè)差異表達(dá)lncRNA(BC070168、AK054728、uc001szi.3、ENST00000489452、ENST00000

5、436499、uc004cff.2)和2個(gè)mRNA NM_000728（與lincRNA-CALCA相關(guān)聯(lián)）和NM_004616（與lincRNA-TSPAN8相關(guān)聯(lián)）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證，檢測(cè)這些基因在兩個(gè)細(xì)胞株中的表達(dá)量。
　　研究結(jié)果:
　　1、單克隆培養(yǎng)共得到25株單克隆細(xì)胞株，編號(hào)依次為1～25號(hào)。其中9株細(xì)胞生長(zhǎng)良好進(jìn)行后續(xù)兩輪篩選，最終得到1株高淋巴轉(zhuǎn)移、低肺轉(zhuǎn)移的細(xì)胞株，命名為HCCLYM-H2細(xì)胞株。病理

6、學(xué)結(jié)果顯示該細(xì)胞株的淋巴轉(zhuǎn)移率為100％，肺轉(zhuǎn)移率為20％。
　　2、單克隆所得HCCLYM-H2細(xì)胞株爪墊接種5周后局部成瘤率為100％，原發(fā)瘤的最大直徑為1.5cm。肝臟原位移植5周后，可見(jiàn)腹主動(dòng)脈旁、髂總及雙側(cè)鎖骨下等遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。病理學(xué)檢查可見(jiàn)肺轉(zhuǎn)移灶及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。
　　3、lncRNA及mRNA在兩株細(xì)胞的差異表達(dá)用HCCLYM-H2/HCCLYM3表示，基因芯片的結(jié)果顯示1629個(gè)mRNA及1483個(gè)lncR

7、NA在兩個(gè)細(xì)胞株中差異表達(dá)（p≤0.05，≥1.5差異倍數(shù)）。這些差異表達(dá)的基因中，306個(gè)lncRNA及717個(gè)mRNA是上調(diào)的，在HCCLYM-H2細(xì)胞株中表達(dá)高于HCCLM3;而1177個(gè)lncRNA和912個(gè)mRNA是下調(diào)的，在HCCLM3細(xì)胞株表達(dá)高于HCCLYM-H2。在HCCLYM-H2細(xì)胞株中差異倍數(shù)最高的是LncRNARP11-672F9.1(ENST00000450980)，差異倍數(shù)為9.54;在HCCLM3細(xì)胞株中

8、差異倍數(shù)最高的兩個(gè)lncRNA為L(zhǎng)incRNA-TSPAN8(BC070168)(差異倍數(shù)為65.7443)and lincRNA-CALCA(AK054728)(差異倍數(shù)為57.2132)。而LincRNA-TSPAN8、lincRNA-CALCA的兩個(gè)相關(guān)mRNA也在兩個(gè)細(xì)胞株中差異表達(dá)。
　　4、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò):兩個(gè)細(xì)胞株的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成不同，表明lncRNA及mRNA的相互調(diào)節(jié)關(guān)系在兩株細(xì)胞中存在差異。在HCCLYM-H2共表

9、達(dá)網(wǎng)絡(luò)中共有132個(gè)lncRNA和306個(gè)mRNA組成的1462個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中680(1462;46.51％)個(gè)節(jié)點(diǎn)表示mRNA與mRNA共表達(dá)關(guān)系，647(44.25％)個(gè)節(jié)點(diǎn)表示mRNA與lncRNA共表達(dá)關(guān)系，其余135(9.23％)個(gè)節(jié)點(diǎn)表示lncRNA與lncRNA的共表達(dá)關(guān)系。在HCCLM3共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中共有173 lncRNAs和398 mRNAs組成的3115個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中1481(3115;47.54％)個(gè)節(jié)點(diǎn)表示mRNA與

10、mRNA的共表達(dá)關(guān)系，1293(41.51％)個(gè)節(jié)點(diǎn)表示mRNA與lncRNA的共表達(dá)關(guān)系，其余341(10.95％)個(gè)節(jié)點(diǎn)表示lncRNA與lncRNA的共表達(dá)關(guān)系。
　　5、實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示:ENST00000436499在HCCLYM-H2細(xì)胞株相對(duì)HCCLM3細(xì)胞株中的差異倍數(shù)為3.7885±0.3855，BC070168，AK054728，uc001szi.3，ENST00000489452，uc004cff.2在

11、HCCLM3相對(duì)HCCLYM-H2細(xì)胞株中的差異倍數(shù)分別為69.7498±6.3728、15.6455±2.5898、13.0636±3.7768、7.0798±3.6812、7.1488±2.3995，PCR的結(jié)果與芯片結(jié)果一致。PCR顯示mRNANM_000728和NM_004616在細(xì)胞株HCCLYM-H中相對(duì)細(xì)胞株HCCLM3中低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與芯片結(jié)果一致。這2個(gè)mRNA在兩個(gè)細(xì)胞株中的表達(dá)量趨勢(shì)跟與其相關(guān)的lncR