大鼠脫細(xì)胞脊髓支架制備及相關(guān)性能的實(shí)驗研究.pdf

1、背景: 脊髓損傷近年來發(fā)病率有增高的趨勢并呈現(xiàn)出高發(fā)生率，高致殘率，高耗費(fèi)，低死亡率的特點(diǎn)。組織工程學(xué)治療脊髓損傷是目前研究的熱點(diǎn)之一，它能整合治療研究的各種有效策略，誘導(dǎo)軸突再生并提供良好的三維通道，減少膠質(zhì)瘢痕和空洞形成。支架是組織工程研究中的關(guān)鍵，目前尚無與脊髓三維結(jié)構(gòu)高度相似且在理化性能也與脊髓相似的支架材料。 近年來一種新的趨勢是采用天然的脫細(xì)胞基質(zhì)作為神經(jīng)組織的修復(fù)材料，即用同種異體來源的材料，采用脫細(xì)胞技術(shù)

2、制備的脫細(xì)胞基質(zhì)，經(jīng)過去細(xì)胞、部分或完全去除有機(jī)質(zhì)或無機(jī)質(zhì)、去抗原等處理，形成生物衍生材料(bio-derived material)，用于組織工程研究。理論上講將脊髓組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理構(gòu)建理想的組織工程支架是可行的，但目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報道。 目的: 通過采用物理凍融結(jié)合化學(xué)萃取方法初步構(gòu)建大鼠脫細(xì)胞脊髓支架并優(yōu)化脫細(xì)胞方案，應(yīng)用HE染色、髓鞘染色及掃描電鏡等方法評價制備脫細(xì)胞脊髓支架的可行性，然后通過對支架的成分分析、

3、免疫原性分析、細(xì)胞毒性、組織相容性，血液相容性、全身毒性反應(yīng)等檢測評價脫細(xì)胞脊髓支架的生物安全性，并將神經(jīng)干細(xì)胞與支架復(fù)合，觀察細(xì)胞在支架材料上的生長情況，評價支架材料的細(xì)胞相容性，從而為構(gòu)建理想的組織工程脊髓支架提供實(shí)驗基礎(chǔ)。 方法: 1.脫細(xì)胞方案的確定：采用凍融結(jié)合化學(xué)萃取方法制備脫細(xì)胞脊髓支架，并應(yīng)用HE染色、髓鞘染色及掃描電鏡等方法檢測脫細(xì)胞效果以確定最合適脫細(xì)胞方案。 2.脫細(xì)胞脊髓支架成分分析及免疫

4、原性檢測：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方案分析支架可能存在的成分；將脫細(xì)胞脊髓支架及同種異體脊髓組織分別進(jìn)行大鼠椎旁皮下埋植后，于術(shù)后1w，2w，3w，4w周取材檢測免疫排斥反應(yīng)情況(免疫組織化學(xué)方法)，評價免疫原性。 3.脫細(xì)胞脊髓支架細(xì)胞毒性及全身毒性研究：通過浸提液與細(xì)胞共培養(yǎng)評價細(xì)胞毒性；通過溶血試驗、凝血時間測定評價血液相容性；通過熱原試驗、全身毒性反應(yīng)評價支架的全身毒性。 4.脫細(xì)胞脊髓支架復(fù)合神經(jīng)干細(xì)胞體外組織工程脊髓

5、構(gòu)建研究：將神經(jīng)干細(xì)胞以不同濃度梯度接種在脫細(xì)胞脊髓支架上進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，觀察細(xì)胞存活情況，比較不同接種密度上架細(xì)胞黏附率(Adhesive rate)，繪制生長曲線。 免疫組化結(jié)果用生物醫(yī)學(xué)圖像分析儀行平均光密度(AOD)分析，以重復(fù)資料的方差分析、t檢驗統(tǒng)計結(jié)果。 結(jié)果及結(jié)論: 1、用凍融結(jié)合化學(xué)萃取法構(gòu)建脫細(xì)胞脊髓組織工程支架是可行的，該支架具有良好的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，脫細(xì)胞徹底，細(xì)胞外基質(zhì)得到保存； 2

6、.構(gòu)建的脫細(xì)胞脊髓支架材料為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有相互溝通的孔隙，其孔徑為6-150μm，孔隙率平均為(93.6±1.5)％，含水能力平均為(58.2±1.6)％。初步顯示出支架材料具有良好的結(jié)構(gòu)性能； 3.構(gòu)建的脫細(xì)胞脊髓支架材料含有Ⅳ型膠原、LN，F(xiàn)N等對細(xì)胞黏附、增殖、分化有利的活性成分，植入大鼠皮下后，未引發(fā)明顯的炎性細(xì)胞浸潤顯示出支架具有極低的免疫原性； 4.構(gòu)建的支架材料對體外NIH3T3細(xì)胞的生長、增殖及代謝無