小鼠心臟脫細(xì)胞支架的制備及初步評價(jià).pdf

1、目的：在改良已有方法基礎(chǔ)上，制備小鼠脫細(xì)胞心臟支架，探究其組成、成分及結(jié)構(gòu)，建立“骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)-脫細(xì)胞心臟支架”共培養(yǎng)體系，評價(jià)脫細(xì)胞心臟支架在細(xì)胞生長、分化等方面的細(xì)胞生物學(xué)特性;探究脫細(xì)胞心臟支架及BMSCs在心臟組織工程研究中潛在應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步開展相關(guān)的組織工程研究及應(yīng)用，建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用胰蛋白酶、十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonⅩ-100)對修剪后的大

2、鼠心臟浸泡震蕩，以快速脫除細(xì)胞。以HE染色觀察支架內(nèi)細(xì)胞殘留;超微分光光度計(jì)檢測脫細(xì)胞支架的DNA殘留;掃描電鏡觀察支架的形態(tài)和纖維排列規(guī)律;Masson染色分析支架的成分;免疫組織化學(xué)染色檢測脫細(xì)胞支架Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、肌紅蛋白、肌動蛋白。選用BMSCs與脫細(xì)胞心臟支架體外構(gòu)建“細(xì)胞-支架復(fù)合物”共培養(yǎng)體系，選擇共培養(yǎng)7d、14d的“細(xì)胞-支架復(fù)合物”，HE染色觀察細(xì)胞在支架中的分布情況;掃描電鏡觀察“細(xì)胞-復(fù)合物”中細(xì)胞的

3、粘附情況。以心肌組織裂解液進(jìn)行定向誘導(dǎo)培養(yǎng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測誘導(dǎo)后“細(xì)胞-支架復(fù)合物”中GATA-4和α-MHC的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、脫細(xì)胞處理后的心臟支架呈半透明囊狀，HE染色觀察未見細(xì)胞核殘留，SEM可見脫細(xì)胞支架由大量纖維構(gòu)成，呈多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
　　2、脫細(xì)胞心臟支架成分的檢測，總DNA含量為43.75±0.03ng/μL;Masson染色可見脫細(xì)胞支架主要由網(wǎng)狀膠原纖維構(gòu)成;免疫組織化學(xué)染色可見，

4、脫細(xì)胞心臟支架主要由Ⅰ型膠原蛋白及少量Ⅲ型膠原蛋白組成，未見細(xì)胞核與肌紅蛋白、肌動蛋白表達(dá)。
　　3、“細(xì)胞-支架復(fù)合物”HE染色可見，細(xì)胞分布在脫細(xì)胞支架內(nèi)部，比較共培養(yǎng)7d、14d的“細(xì)胞-支架復(fù)合物”，支架內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量明顯增加;SEM觀察可見BMSCs緊密粘附在支架纖維表面;RT-PCR的結(jié)果顯示:定向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的“細(xì)胞-支架復(fù)合物”中，可檢測到α-MHC、GATA-4表達(dá)，其表達(dá)量分別與“竹節(jié)樣”和“肌管樣”結(jié)構(gòu)階段相當(dāng)