新型熒光標記試劑SPA-EGFP融合蛋白的應(yīng)用研究.pdf

1、以熒光標記物為探針的熒光免疫測定法(fluorescence immunoassay，F(xiàn)IA)始創(chuàng)于20世紀40年代初，是一種歷史悠久的標記免疫測定法。其原理就是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合，以熒光物質(zhì)標記抗體，對組織或細胞內(nèi)的抗原物質(zhì)進行定位檢測。由于FIA的特異性、快速性和在細胞水平定位的準確性，并隨著各種新的熒光物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)及標記方法的不斷改進，F(xiàn)IA在免疫學、微生物學、病理學、腫瘤學以及臨床檢驗等許多方面

2、已得到廣泛應(yīng)用，日益發(fā)揮重要的作用。 本研究在實驗室前期研究的基礎(chǔ)上，對構(gòu)建好的GS115/pPIC9K/spa-egfb工程菌進行誘導表達。BMMY培養(yǎng)基中甲醇的添加由24小時補充一次改為12小時補充一次，省略原先要添加的組氨酸和1％的Casamino acids，結(jié)果顯示對表達效果沒有明顯的影響。表達上清液經(jīng)HisTrap HP柱兩次純化，收率分析得出兩次總收率可達63.3％，平均收率可提高23.2％。獲得SPA-EGFP融

3、合蛋白純度達95％，完全符合熒光免疫檢測應(yīng)用的需要。 本研究利用純化的SPA-EGFP融合蛋白作為熒光標記試劑，采用間接免疫熒光檢測法，以乙肝病毒表面抗體作為檢測對象，對SPA-EGFP融合蛋白的檢測條件進行研究。結(jié)果顯示以pH7.2，100mM PBS緩沖液(加0.1％Tween 20)作為洗脫液應(yīng)用于SPA-EGFP融合蛋白的間接免疫熒光檢測時，洗脫效果較理想，是較為適宜的洗脫液。實驗結(jié)果顯示抗原抗體復合物經(jīng)SPA-EGFP

4、融合蛋白標記，在倒置熒光顯微鏡的藍光激發(fā)下觀察，呈現(xiàn)為明亮的綠色熒光斑，而背景呈較為均一的黑色，可辨程度高。長時間觀察時，熒光強度基本不變，無明顯淬滅現(xiàn)象。 我們利用上述檢測條件對283份體檢血清進行乙肝表面抗體(hepatitis B surface antibody，HBsAb)的FIA檢測，并采用ELISA法進行同步檢測。結(jié)果顯示陽性檢出率FIA為72.08％，ELISA為73.85％，兩種檢測方法具有較高的一致性，其檢測

5、結(jié)果的一致性高達98.23％。可見利用我們確定的洗脫液配方，SPA-EGFP-FIA對乙肝抗體的檢測是切實可行，并且效果良好的。 本研究用SPA-EGFP融合蛋白代替EUROIMMUN抗核抗體檢測試劑盒中的FITC標記的羊抗人IgG抗體，通過間接免疫熒光法檢測已經(jīng)確診的系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)病人血清。研究顯示25份血清樣品全部顯示陽性，SPA-EGFP融合蛋白的熒光模式