PAMAM-D載雙靶向自殺基因系統(tǒng)對前列腺癌細(xì)胞系LNCaP殺傷作用的實(shí)驗研究.pdf

1、第一部分、前列腺特異性的雙基因重組質(zhì)粒pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43的構(gòu)建及鑒定
　　 目的：構(gòu)建前列腺特異性的雙基因重組質(zhì)粒pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43，為前列腺癌的基因治療實(shí)驗研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：獲取Cx43基因并克隆至pMD19-T Simple質(zhì)粒；合成HSV-TK基因并克隆到pIRES的MCS A中，得pIRES-TK；獲取PSMAe/p并克隆至pIRES-TK中替換CMV啟動

2、子，得pIRES-PSMAe/p-TK；將Cx43基因克隆到pIRES-PSMAe/p-TK的MCS B中，得pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43，對此質(zhì)粒雙酶切鑒定并測序；pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43轉(zhuǎn)染人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP，RT-PCR觀察TK及Cx43基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果：合成的各質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳可見目的基因條帶；pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43經(jīng)序與預(yù)期設(shè)計相符；pIR

3、ES-PSMAe/p-TK-Cx43轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞，RT-PCR顯示HSV-TK及Cx43基因的mRNA成功表達(dá)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了前列腺特異性的含HSV-TK及Cx43的雙基因重組質(zhì)粒pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43。
　　 第二部分、PAMAM-D載雙靶向自殺基因系統(tǒng)對前列腺癌細(xì)胞系LNCaP殺傷作用的體外與體內(nèi)實(shí)驗研究
　　 目的：建立一種新型的非病毒載體自殺基因輸送、表達(dá)體系，并探討其

4、對前列腺癌細(xì)胞系LNCaP的殺傷效果。
　　 方法：（1）體外細(xì)胞實(shí)驗：將G5-PAMAM-D-fol和G5-PAMAM-D兩種載體材料與pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43、pIRES-PSMAe/p-TK、pIRES-TK三種不同質(zhì)?；旌戏謩e轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞，共分10組，按分組情況給予GCV及吉西他濱。各組行RT-PCR及Western blot檢測HSV-TK與Cx43基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)染24h后以MTT法檢測細(xì)胞增殖

5、情況，應(yīng)用Annexin V-FITC試劑染色后以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。（2）原位基因治療動物實(shí)驗：用LNCaP細(xì)胞制備前列腺癌皮下荷瘤鼠模型，共分8組，按分組情況給予GCV及吉西他濱，觀察整個治療過程中腫瘤的體積以及治療結(jié)束后的腫瘤重量，并取出腫瘤行病理學(xué)檢查及Western blot檢測HSV-TK及Cx43表達(dá)。
　　 結(jié)果：（1）體外細(xì)胞實(shí)驗：①RT-PCR及Western blot檢測顯示A、B、C、D、E、F組

6、均有TK基因的表達(dá)，A、B兩組還有Cx43基因表達(dá)，而G、H、I、J組均未見此兩種基因的的表達(dá)。②MTT檢測顯示：I組和J組相比，兩組的OD值無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；A-H組的OD值均明顯小于I組和J組（P<0.05），其中G組和H組相比，兩組的OD值無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）：在GCV濃度很低時（0.1μg/ml和1μg/ml）：A-F組與G、H組相比，P值均大于0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義，而自GCV濃度達(dá)到5μg/ml起，A-F

7、組OD值均明顯小于G、H組（P<0.05）；A-F組任意兩組之間的OD值比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。細(xì)胞抑制率圖反映出：隨著GCV濃度的增加，A-F組的LNCaP細(xì)胞生長抑制率亦增加，體現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，且以A組的趨勢最為明顯；而G、H組對細(xì)胞的抑制作用并未體現(xiàn)出隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)的趨勢，且對細(xì)胞的生長抑制率處于較低的水平；I組幾乎對細(xì)胞的生長無抑制作用。③凋亡染色流式細(xì)胞計數(shù)顯示：A組細(xì)胞的早期凋亡率為15.02±0.

8、39％，明顯高于其它各組（P<0.05）；I組和J組早期細(xì)胞凋亡率相比無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），G組和H組相比早期凋亡率無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），但G、H組與I、J組相比，早期凋亡率要高（P<0.05）；B-F各組細(xì)胞早期凋亡率明顯高于G、H、I、J組（P<0.05），且B-F各組之間的早期凋亡率相比均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。（2）原位基因治療動物實(shí)驗：①第一組至第四組（材料與質(zhì)?；旌限D(zhuǎn)染治療組）與第五至第八組（不同的對照

9、組）相比，在整個治療過程中腫瘤體積均明顯減?。≒<0.05），特別是在治療的前兩個周期，腫瘤的生長更為緩慢，但隨著腫瘤體積增大，抑瘤效果降低；第一組至第四組組間相比，腫瘤體積差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且第一組腫瘤體積最小。②治療結(jié)束后，四個治療組與四個對照組相比，腫瘤重量明顯較輕（P<0.05）；治療組組間比較，除了第二組與第四組的差別無統(tǒng)計學(xué)意義以外（P>0.05），各組間差別均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；而四個對照組組間相

10、比統(tǒng)計學(xué)上無差別（P>0.05）。③取腫瘤組織行Western blot檢測，第一組至第四組有TK表達(dá)，而第一組和第二組還有Cx43表達(dá)。④腫瘤組織行病理檢查顯示治療組對腫瘤有明顯的殺傷作用。
　　 結(jié)論：G5-PAMAM-D-fol作為非病毒基因載體對前列腺癌細(xì)胞系LNCaP靶向性強(qiáng)且毒性較低；重組質(zhì)粒pIRES-PSMAe/p-TK-Cx43可靶向轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞系LNCaP并成功表達(dá)目的基因，Cx43及吉西他濱均可增強(qiáng)HS