GNMT的表達(dá)及調(diào)控對(duì)人前列腺癌細(xì)胞系LNCap和PC3生物學(xué)特性的影響.pdf

1、前列腺癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)及我國(guó)均呈逐年上升趨勢(shì)，眾多的分子生物學(xué)及遺傳學(xué)機(jī)制主導(dǎo)著這一疾病的進(jìn)程。Sreekumar等通過(guò)代謝組學(xué)的研究方法，發(fā)現(xiàn)肌氨酸與前列腺癌的發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān)。它在前列腺癌尤其是侵襲性前列腺癌組織中的濃度明顯高于良性前列腺增生組織中的濃度，并且進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在良性前列腺增生細(xì)胞系中加入肌氨酸后可以使細(xì)胞具有侵襲性。組織細(xì)胞中的肌氨酸濃度受到甘氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(GNMT)的調(diào)節(jié)而發(fā)生變化。最新研究發(fā)現(xiàn)，前列

2、腺癌細(xì)胞比正常前列腺上皮細(xì)胞表達(dá)更多的GNMT，并且敲除GNMT基因可以抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。因此，調(diào)節(jié)GNMT的表達(dá)或功能，有望為前列腺癌的發(fā)生及進(jìn)展機(jī)制和治療方法的研究提供一種全新的思路。GNMT作為一種具有多種功能的蛋白質(zhì)，其甲基轉(zhuǎn)移酶的活性可以被其催化產(chǎn)物S-腺苷高半胱氨酸(SAH)所抑制，這種作用在體外及體內(nèi)均可觀(guān)察到，并且SAH還可以在轉(zhuǎn)錄水平上抑制GNMT的表達(dá)。維甲酸(retinoic acid，RA)可以

3、顯著增加小鼠體內(nèi)GNMT的活性，并可在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)其表達(dá)。因此，我們可以嘗試?yán)肧AH和RA來(lái)實(shí)現(xiàn)體外和體內(nèi)對(duì)GNMT表達(dá)及活性的調(diào)控，從而進(jìn)行進(jìn)一步的研究。目前尚無(wú)研究證實(shí)，外源性調(diào)控GNMT是否能夠改變前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，而這正是我們這一研究試圖回答的問(wèn)題。我們旨在通過(guò)對(duì)GNMT的體外及體內(nèi)調(diào)控，觀(guān)察其對(duì)人前列腺癌細(xì)胞系LNCap和PC3的分化、凋亡、增殖、侵襲性以及成瘤能力的影響，從而對(duì)前列腺癌的發(fā)生機(jī)制及治療途徑進(jìn)行新的

4、探索。
　　第一部分GNMT在人前列腺癌細(xì)胞系LNCap和PC3中的表達(dá)
　　目的:研究不同侵襲性的人前列腺癌細(xì)胞系LNCap和PC3中GNMT的表達(dá)差異，分析GNMT與前列腺癌細(xì)胞侵襲性的關(guān)系。
　　方法:RT-PCR檢測(cè)LNCap和PC3細(xì)胞內(nèi)GNMT mRNA的表達(dá)，Western Blot檢測(cè)兩種細(xì)胞內(nèi)GNMT蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:LNCap細(xì)胞中GNMT mRNA的相對(duì)表達(dá)量為(1.000±0.331

5、)，PC3細(xì)胞中GNMT mRNA的相對(duì)表達(dá)量為(2.579±0.863)，二者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05。LNCap細(xì)胞中GNMT蛋白的相對(duì)表達(dá)量為(0.341±0.072)，PC3細(xì)胞中GNMT蛋白的相對(duì)表達(dá)量為(0.841±0.116)，二者的差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p＜0.01。
　　結(jié)論:GNMT的表達(dá)量和前列腺癌細(xì)胞系的侵襲性相關(guān)，侵襲性較高的PC3細(xì)胞中表達(dá)較高，侵襲性較低的LNCap細(xì)胞中表達(dá)較低。
　　第

6、二部分GNMT的體外調(diào)控對(duì)人前列腺癌細(xì)胞系LNCap和PC3生物學(xué)特性的影響
　　目的:研究GNMT的體外調(diào)控對(duì)人前列腺癌細(xì)胞系LNCap和PC3的分化、凋亡、增殖和侵襲性等各項(xiàng)生物學(xué)特性的影響。
　　方法:細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入GNMT（10μg/ml）和SAH(10 ng/ml)來(lái)上調(diào)和下調(diào)LNCap和PC3細(xì)胞內(nèi)GNMT的活性。在12h、24h、36h和48h這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，光鏡下觀(guān)察細(xì)胞分化，TUNEL和流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)

7、胞凋亡，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲性。
　　結(jié)果:①光鏡觀(guān)察第48h，GNMT和SAH處理過(guò)的LNCap和PC3細(xì)胞形態(tài)在200倍光鏡下觀(guān)察，均沒(méi)有發(fā)生明顯變化，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至5d后結(jié)果仍是一樣。②TUNEL兩種細(xì)胞中凋亡率，GNMT組均低于對(duì)照組，SAH組均高于對(duì)照組。其差異在LNCap細(xì)胞中GNMT組和對(duì)照組之間，第48h無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＞0.05，第12h、24h和36h有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.0

8、5; SAH組和對(duì)照組之間，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05。在PC3細(xì)胞中GNMT組和對(duì)照組之間，第12h和48h無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＞0.05，第24h和36h有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05; SAH組和對(duì)照組之間，第12h無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＞0.05，第24h、36h和48h有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05。③流式細(xì)胞兩種細(xì)胞中凋亡率，GNMT組均低于對(duì)照組，SAH組均高于對(duì)照組。其差異在LNCap細(xì)胞中3組之間兩兩比較，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有顯著

9、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.01。在PC3細(xì)胞中GNMT組和對(duì)照組之間，第48h無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＞0.05，第12h、24h和36h有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05; SAH組和對(duì)照組之間，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.01。④MTT兩種細(xì)胞中吸光度值，GNMT組均高于對(duì)照組，SAH組均低于對(duì)照組。其差異只在PC3細(xì)胞中的48h時(shí)間點(diǎn)SAH組與對(duì)照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05。⑤Transwell兩種細(xì)胞中穿膜細(xì)胞數(shù)，GNMT組均高于對(duì)照

10、組，SAH組均低于對(duì)照組。其差異在兩種細(xì)胞中均在36h和48h時(shí)間點(diǎn)才有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05。
　　結(jié)論:在細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入GNMT和SAH，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)GNMT的體外調(diào)控，可以改變前列腺癌細(xì)胞系LNCap和PC3除細(xì)胞分化以外的各項(xiàng)生物學(xué)特性。GNMT活性上調(diào)表現(xiàn)出的作用:可以抑制LNCap和PC3細(xì)胞凋亡，并且程度與細(xì)胞的雄激素依賴(lài)特性無(wú)關(guān);對(duì)LNCap和PC3細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯影響;可以增加前列腺癌細(xì)胞，尤其是PC3細(xì)

11、胞的侵襲性。GNMT活性下調(diào)表現(xiàn)出的作用:可以促進(jìn)LNCap和PC3細(xì)胞凋亡，并且程度與細(xì)胞的雄激素依賴(lài)特性無(wú)關(guān);可以抑制PC3細(xì)胞增殖，但是不能抑制LNCap細(xì)胞增殖;可以減弱LNCap和PC3細(xì)胞的侵襲性，并且程度與細(xì)胞的雄激素依賴(lài)特性無(wú)關(guān)。
　　第三部分GNMT的體內(nèi)調(diào)控對(duì)人前列腺癌細(xì)胞系PC3成瘤作用的影響
　　目的:研究GNMT的體內(nèi)調(diào)控對(duì)PC3細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響。
　　方法:將人前列腺癌細(xì)胞系PC

12、3注入裸鼠皮下成瘤。隨機(jī)分為3組，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組每天分別喂食順式維甲酸(CRA，30μmol/kg)和S-腺苷高半胱氨酸(SAH，10 g/kg)，對(duì)照組正常飲食，連續(xù)6周，每周測(cè)量腫瘤的大小，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)，處死后免疫組化檢測(cè)瘤體內(nèi)GNMT的表達(dá)。
　　結(jié)果:6周后，腫瘤體積CRA組比對(duì)照組明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.05;SAH組比對(duì)照組明顯縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， p＜0.05。瘤體內(nèi)GNMT表達(dá)CRA組比對(duì)照組明顯增