CircRNA--CDR1as在前列腺癌細(xì)胞系中的功能及作用機制研究.pdf

1、作為男性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，前列腺癌(PCa)發(fā)病率隨年齡增長而增加，一項最新研究報告表明PCa在美國男性癌癥發(fā)病率中排在第1位，病死率中排在第2位。近年來我國男性前列腺癌發(fā)病率持續(xù)升高，在上海地區(qū)，前列腺癌發(fā)病率已位列男性常見腫瘤第5位和泌尿系統(tǒng)腫瘤第1位，因此研究PCa發(fā)生發(fā)展的分子機制，為腫瘤的治療提供理論依據(jù)顯得越來越重要。
　　環(huán)狀RNA(Circular RNA，circRNA)是一種通過反向剪接機制由線性RNA

2、前體的5'端和3'端共價相接形成的非編碼RNA，與基因的轉(zhuǎn)錄及后轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控有關(guān)。近年，circRNA逐漸被發(fā)現(xiàn)不僅存在于細(xì)菌、真菌、植物中，也大量存在于哺乳動物中。作為一種競爭性內(nèi)源RNA(CeRNA)，circRNA與miRNA、lncRNA及蛋白之間具有相互作用的關(guān)系。隨著研究的不斷深入，circRNA先后被證明與多種疾病及腫瘤進(jìn)程有關(guān)，因其表達(dá)量豐富、具有獨特的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)和組織表達(dá)特異性，有望為相關(guān)疾病及腫瘤發(fā)生發(fā)展機制提供新的理

3、論依據(jù)。
　　首先我們對三種細(xì)胞系的測序結(jié)果進(jìn)行實時熒光定量PCR(RT-qPCR，以下簡稱qPCR)驗證，得到了與測序結(jié)果一致的結(jié)論，然后利用qPCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測circRNA CDR1as特性，并選取表達(dá)相對較高的兩種細(xì)胞系PC3及C4-2進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)驗證，在兩種高表達(dá)細(xì)胞系中通過siRNA干擾方法下調(diào)CDR1as表達(dá)量后進(jìn)行CCK8檢測、Edu增殖實驗、流式細(xì)胞術(shù)周期及凋亡實驗、transwell遷移及侵襲實驗等，

4、結(jié)果表明CDR1as可以影響前列腺癌細(xì)胞的增殖、周期、遷移和侵襲功能。核質(zhì)分離實驗、miRIP實驗表明CDR1as主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，并可能通過miR-23a/b等調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，mRNA高通量測序以及qPCR結(jié)果證明CDR1as表達(dá)下調(diào)后CCND1及CXCL5表達(dá)量發(fā)生變化，并得到Western blot實驗的證明，多個數(shù)據(jù)庫預(yù)測軟件表明miR-23a/b與CCND1及CXCL5具有結(jié)合位點，相關(guān)報道表明CCND1和CXCL5與腫

5、瘤細(xì)胞周期及轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。
　　總之，circRNA之前的研究重點在于對其形成機制的闡明，目前研究較多的是其在疾病中的功能作用，因circRNA具有穩(wěn)定性好、保守性高、表達(dá)特異性強等特點，無論對于研究疾病發(fā)生機制還是作為診斷的生物標(biāo)記物都有重要的研究價值。我們的結(jié)果證實了CDR1as作為ceRNA通過吸附miR-23a/b抑制其功能，進(jìn)而增加CCND1和CXCL5的表達(dá)，促進(jìn)PCa的進(jìn)展。我們首次報道CDR1as作為ceRNA在P

6、Ca發(fā)生發(fā)展中的作用機制，并可能作為PCa治療的一個潛在靶點以及可能作為診斷PCa的生物標(biāo)志物。
　　第一部分 前列腺癌相關(guān)細(xì)胞系circRNA表達(dá)譜分析
　　目的：探索circRNA在前列腺癌相關(guān)RWPE-1、22RV1和PC3三種細(xì)胞系中的表達(dá)譜。
　　方法：(1)通過circRNA的特異性測序法富集circRNA。(2)通過高通量測序?qū)φＧ傲邢偕掀ぜ?xì)胞RWPE-1、前列腺癌上皮細(xì)胞22RV1和前列腺腺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)

7、移細(xì)胞PC3的circRNA表達(dá)譜進(jìn)行檢測。(3)對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。(4)對測序結(jié)果進(jìn)行qPCR驗證。
　　結(jié)果：(1)三種細(xì)胞系共識別出9545種circRNA。(2)三種細(xì)胞系差異表達(dá)的circRNA有數(shù)百種。(3)GO分析和KEGG通路分析表明差異表達(dá)circRNA的宿主基因與前列腺癌疾病進(jìn)展密切相關(guān)。(4)與RWPE-1相比，PC3中CDR1as上調(diào)近200倍。(5)CDR1as有多個miRNA結(jié)合位點，如mi

8、R-7-5p等。
　　結(jié)論：CircRNA在前列腺癌細(xì)胞系中表達(dá)量十分豐富，差異表達(dá)circRNA較多，與前列腺癌的發(fā)展可能存在密切關(guān)聯(lián)，CDR1as在PC3中表達(dá)量增加，且與miRNA關(guān)系密切，可能影響前列腺細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。
　　第二部分 CircRNA-CDR1as在前列腺癌細(xì)胞系及組織中的表達(dá)量分析
　　目的：在前列腺癌細(xì)胞系及組織中對CDR1as測序結(jié)果進(jìn)行檢測、驗證及表達(dá)量分析。
　　方法：(1)

9、通過前期的高通量測序，我們獲得了CDR1as的序列結(jié)果，并與Circnet數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了對比，最終確定了我們測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。(2)對CDR1as表達(dá)量的測序結(jié)果我們在測序的三個細(xì)胞系中利用qPCR進(jìn)行了驗證。(3)對擴增片段進(jìn)行了sanger測序，來驗證我們結(jié)果的可靠性。(4)增加三個前列腺癌細(xì)胞系(LNCaP、DU145和C4-2)以及腎癌細(xì)胞系786O和膀胱癌細(xì)胞系T24，驗證CDR1as表達(dá)特異性。(5)通過cDNA及gDNA的反

10、、對向引物擴增以及瓊脂糖凝膠電泳驗證其cbcRNA的特性。(6)利用RNA酶R消化來驗證其circRNA的穩(wěn)定性。(7)利用核質(zhì)分離的方法進(jìn)行分子在細(xì)胞中的分布定位。(8)CDR1as在65對癌與癌旁組織中表達(dá)量分析。
　　結(jié)果：(1)CDR1as是一條X染色體上反義鏈來源circRNA，含有1485個堿基，其circRNA ID為has-circ-0001946chrX：139865339-139866824。(2)CDR1as

11、在PC3中表達(dá)量是RWPE-1中的近1000倍，是22RV1中的近30倍。(3)Sanger測序的序列經(jīng)匹配確定擴增片段準(zhǔn)確無誤。(4)CDR1as在前列腺癌細(xì)胞系PC3中特異性表達(dá)，并且在C4-2中表達(dá)量也較高，約為RWPE-1的200倍。(5)反向引物只在cDNA中有擴增結(jié)果，而對向引物在兩者中均有擴增產(chǎn)物，說明在基因組中不存在與其序列相類似的環(huán)狀DNA分子。(6)RNA酶R消化后對照線性分子的表達(dá)量下降程度顯著高于對CDR1as的

12、表達(dá)量影響。(7)核質(zhì)分離結(jié)果表明CDR1as主要分布于細(xì)胞質(zhì)中。(8)癌與癌旁CDR1as的表達(dá)量差值與PSA值呈正相關(guān)關(guān)系，r=0.30。
　　結(jié)論：CDR1as是一條X染色體上反義鏈來源circRNA，主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，在前列腺癌細(xì)胞系PC3及C4-2中特異高表達(dá)。
　　第三部分 CircRNA-CDR1as的功能鑒定
　　目的：探索CDR1as對前列腺癌細(xì)胞功能的影響。
　　方法：(1)轉(zhuǎn)染siRNA以

13、干擾CDR1as表達(dá)。(2)利用CCK8法檢測CDR1as干擾表達(dá)的細(xì)胞PC3和C4-2的增殖能力。(3)通過流式細(xì)胞術(shù)實驗檢測CDR1as干擾表達(dá)的細(xì)胞PC3和C4-2細(xì)胞的周期和凋亡情況。(4)使用transwell小室檢測CDR1as干擾表達(dá)的細(xì)胞PC3和C4-2細(xì)胞的遷移和侵襲能力。(5)利用病毒轉(zhuǎn)染的方式構(gòu)建CDR1as敲低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株。(6)采用CDR1as敲低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株進(jìn)行小鼠皮下荷瘤模型的構(gòu)建，進(jìn)而探究其對成瘤能力的影

14、響。
　　結(jié)果：(1)SiRNA效率較高，轉(zhuǎn)染后CDR1as表達(dá)下調(diào)80％以上。(2)CDR1as干擾表達(dá)后兩種細(xì)胞增殖受到抑制。(3)CDR1as干擾表達(dá)后細(xì)胞周期阻滯在G1期，對凋亡無影響。(4)CDR1as干擾表達(dá)后細(xì)胞的遷移和侵襲能力減弱。(5)穩(wěn)轉(zhuǎn)株的CDR1as敲低效率在90％以上。(6)CDR1as敲低表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)株成瘤能力降低。
　　結(jié)論：CDR1as通過周期影響前列腺癌細(xì)胞增殖，不影響凋亡，CDR1as促進(jìn)前

15、列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，CDR1as敲低表達(dá)后可降低癌細(xì)胞的成瘤能力。
　　第四部分 CircRNA-CDR1as在前列腺癌細(xì)胞中作用機制分析
　　目的：探索環(huán)狀RNA CDR1as促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移的作用機制。
　　方法：(1)采用miRIP方式探索與CDR1as結(jié)合的miRNA。(2)采用mRNA測序的方式對CDR1as干擾表達(dá)的細(xì)胞系進(jìn)行測序以尋找下游的靶點mRNA。(3)RT-qPCR方式驗證測序結(jié)

16、果。(4)采用多組數(shù)據(jù)庫對靶點mRNA與miRNA結(jié)合位點進(jìn)行預(yù)測。(5)雙熒光素酶報告基因檢測篩選的miRNA是否與CDR1as結(jié)合。(6)采用miRNA mimics轉(zhuǎn)染方式和miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染補救實驗方式進(jìn)一步驗證CDR1as、miRNA、mRNA三者之間的關(guān)系。(7)Western blot方式對EMT marker進(jìn)行驗證。
　　結(jié)果：(1)CDR1as可吸附miR-183、miR-23a、miR-23b等miRNA。

17、(2)CDR1as表達(dá)干擾后CCND1和CXCL5基因表達(dá)下調(diào)。(3)CCND1與miR-183、miR-23a/b存在結(jié)合位點，CXCL5與miR-183、miR-23a/b、miR-200b/c存在結(jié)合位點。(4)雙熒光素酶報告基因檢測實驗證明CDR1as與miR23a/b之間存在相互作用。(5)MiR23a/b過表達(dá)后CCND1和CXCL5基因表達(dá)量下調(diào)，CDR1as干擾表達(dá)后miRNA23a/b抑制劑轉(zhuǎn)染補救可使CCND1和CX

18、CL5表達(dá)量恢復(fù)。(6)Western blot結(jié)果表明，CDR1as干擾表達(dá)后CCND1和CXCL5蛋白水平表達(dá)下降，Ncadherin和Snail在PC3的兩干擾組中表達(dá)量下調(diào)，Ecadherin在C4-2兩干擾組中明顯上調(diào)而Snail在C4-2兩干擾組中明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：CDR1as通過miR-23a/23b調(diào)節(jié)CCND1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞周期進(jìn)程，同時也通過miR-23a/b調(diào)節(jié)分泌因子CXCL5的表達(dá)，改變