胰島素受體底物-1對成骨細(xì)胞增殖分化及OPG-RANKL和MMPs表達(dá)的影響.pdf

1、目的：觀察胰島素受體底物-1在小鼠前成骨樣MC3T3-E1細(xì)胞分化過程中的表達(dá)以及17 β-雌二醇對其的影響。 方法：應(yīng)用1 0mM β-甘油磷酸鈉和501．ug／ml抗壞血酸誘導(dǎo)小鼠前成骨樣MC3T3-E1細(xì)胞分化成熟，分別在0、6、12、18、24和30天收集細(xì)胞。用α-磷酸奈酚法測定堿性磷酸酶活性；放射免疫法測定骨鈣素含量；半定量RT-PCR檢測胰島素受體底物-1(IRS-1)、I型膠原、骨涎蛋白和骨橋素的mRNA表達(dá)；免

2、疫印跡法檢測：MC3T3-E1細(xì)胞分化過程中不同時間點IRS-1蛋白的表達(dá)；用茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成。并予17β-雌二醇干預(yù)，用半定量RT-PCR和免疫印跡法檢測干預(yù)組和對照組細(xì)胞IRS-l mRNA和蛋白的表達(dá)，比較兩組細(xì)胞IRS-1表達(dá)量的變化。 結(jié)果：在小鼠前成骨樣MC3T3-E1細(xì)胞分化成熟過程中，I型膠原在MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)早期即有表達(dá)(0.32±0.02)，其表達(dá)量隨細(xì)胞的成熟而逐漸增高，6天達(dá)高峰(0.6

3、5±0.13)，之后略有下降(0.44±0.03)。堿性磷酸酶活性迅速上升，18天達(dá)高峰(28.93±3.3 1/L)，之后逐漸下降(10.58±1.23/L)。骨鈣素含量隨培養(yǎng)時間延長而逐漸增高，18天之后顯著升高(0.78±0.07ng/mg protein)。骨橋素隨培養(yǎng)時間延長表達(dá)量逐漸增高，24天達(dá)高峰(0.67±0.12)。骨涎素在早期幾乎無表達(dá)，培養(yǎng)6天后可檢測到其表達(dá)(0.09±0.01)，之后逐漸增高，24天達(dá)高峰(0

4、.43±0.05)。茜素紅染色可見MC3T3-E1細(xì)胞于18天開始出現(xiàn)明顯的細(xì)胞生長聚集，30天可形成典型的礦化結(jié)節(jié)。IRS-1 mRNA和蛋白的表達(dá)在MC3T3-E1細(xì)胞分化成熟過程中逐漸增高。IRS-1的表達(dá)量與I型膠原、骨鈣素、骨涎素和骨橋素呈正相關(guān)。經(jīng)雌激素干預(yù)后，各時間點IRS-1 mRNA和蛋白表達(dá)均增加，以培養(yǎng)第12天及以后的干預(yù)影響最為明顯，而且可促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)形成。 結(jié)論：β-甘油磷酸鈉及抗壞血酸干預(yù)能分別在培養(yǎng)

5、的第6～12天、12～24天、24～30天誘導(dǎo)前成骨樣細(xì)胞MC3T3一El的增殖、成熟與礦化；IRS-1參與MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、成熟與礦化的全過程，可能在17β-雌二醇誘導(dǎo)的骨轉(zhuǎn)換過程中起著重要作用。 目的：觀察胰島素受體底物-1表達(dá)受阻對小鼠前成骨樣MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化、凋亡及OPG／RANKL表達(dá)的影響。 方法：針對小鼠IRS-1基因的3個區(qū)域1135～1155、1429～1447和4432～445

6、2合成shRNA(shRNAl、shRNA2、shRNA3)，以pGenesil-1 vector為載體構(gòu)建帶綠色熒光蛋白(GFP)靶標(biāo)的shRNA質(zhì)粒。以脂質(zhì)體Lipofectamin<'TM>2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞，并設(shè)陰性對照(HK)載體轉(zhuǎn)染組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)狀況而確定轉(zhuǎn)染效率，G418篩選穩(wěn)定表達(dá)的陽性克隆并通過半定量RT-PCR和Western Blot鑒定。用MTT法

7、測定細(xì)胞存活率，[<'3>H]-脫氧脲嘧啶摻入法檢測細(xì)胞的增殖活性。流式細(xì)胞分析法和吖啶橙／溴乙啶染色觀察細(xì)胞調(diào)亡。堿性磷酸酶用全自動生化儀檢測，骨鈣素用放射免疫測定法測定。用半定量RT-PCR和WestemBlot檢測IRS-1、I型膠原、OPG和RANKL的表達(dá)。礦化結(jié)節(jié)用茜素紅染色。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染后48小時，在熒光顯微鏡下觀察可見部分細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)的陽性克隆。與空白對照組和陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染I

8、RS-1 shRNAl～3質(zhì)粒的MC3T3-E1細(xì)胞IRS-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均降低70％以上。IRS-1基因沉默后MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性降低，凋亡增加。堿性磷酸酶、骨鈣素和I型膠原表達(dá)降低，OPG和RANKL表達(dá)亦降低，礦化結(jié)節(jié)形成減少。結(jié)論：針對小鼠IRS-1 mRNA三個區(qū)域設(shè)計、構(gòu)建的shRNA質(zhì)粒可有效抑制MC3T3-E1細(xì)胞IRS-1基因的表達(dá)。IRS-1基因沉默可抑制MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性與分化，促進(jìn)成

9、骨細(xì)胞凋亡，阻止成骨細(xì)胞表達(dá)促破骨細(xì)胞分化因子(RANKL)，說明IRS-1不但能直接調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞參與的骨形成，而且能通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞間的耦聯(lián)，在骨吸收中發(fā)揮重要作用。 第三部分shRNA干擾沉默胰島素受體底物-1對MC3T3-E1細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子的影響 目的:觀察胰島素受體底物-1表達(dá)受阻對小鼠前成骨樣MC3T3-E1細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子的影響。 方法：免疫印跡法檢測空白對照組