根瘤菌耐鹽工程菌株的構建及其生理特性研究.pdf

1、本論文主要針對慢生根瘤菌普遍存在耐鹽性差的特點，以及這些資源難以在我國大面積應用的現狀，選擇與兩種主要豆科植物—花生和大豆共生結瘤良好的花生根瘤菌(Bradyrhizobiumsp.(Arachis)2764)和大豆慢生根瘤菌(BradyrhizobiumjaponicumUSDA110)為材料，運用基因工程的手段，將與生物耐鹽相關的兩個基因-betH(初步確定編碼甘氨酸甜菜堿轉運蛋白)及betAB(編碼甘氨酸甜菜堿合成蛋白)分別導入根

2、瘤菌，構建耐鹽的根瘤菌工程菌株，并進行耐鹽基因表達及生理特性的相關測定分析。論文的主要結果摘要如下： 1、將編碼甘氨酸甜菜堿轉運蛋白的基因betH導入根瘤菌，獲得工程菌354株，其中以質粒形式存在的工程菌4株，基因插入到基因組上的工程菌350株。經耐鹽性篩選，有2株工程菌(2764/pSZ1.5、110/pSZ1.5)的耐鹽性由80mM提高到120mM，較出發(fā)菌株提高50％。 2、將編碼甘氨酸甜菜堿合成蛋白的基因betA

3、B導入根瘤菌，構建以質粒形式存在的工程菌2株，經耐鹽性篩選，有1株工程菌(2764/betAB)的耐鹽性由80mM提高到120mM，較出發(fā)菌株提高50％。 3、對轉入上述2個與耐鹽相關基因表達的研究結果表明，工程菌2764/betAB耐鹽性的提高與甜菜堿的含量正相關，其甜菜堿含量是出發(fā)菌株的3.2倍；而工程菌2764/pSZ1.5、110/pSZ1.5的甜菜堿含量較出發(fā)菌株卻未見明顯變化。進一步測定工程菌2764/pSZ1.5、

4、110/pSZ1.5細胞內游離氨基酸含量，發(fā)現其中5種氨基酸含量有明顯變化，推測它們與根瘤菌的耐鹽性相關。 4、對耐鹽工程菌進行了生長速度(代時)、耐旱性、穩(wěn)定性和結瘤能力等生理特性方面的測定，結果表明：(1)工程菌與出發(fā)菌株的代時相差1-2小時，導入betH和betAB基因可延緩菌的生長繁殖速度，但變化不明顯；(2)工程菌的耐旱性都略低于或與出發(fā)菌株的耐旱性相當，暗示導入基因與耐旱性不直接相關；(3)整合到基因組上的外源基因可

5、穩(wěn)定存在，2764/pSZ1.5、110/pSZ1.5因基因插入到基因組上，在無選擇壓力下，連續(xù)轉接5次后基因仍穩(wěn)定存在，而2764/betAB的穩(wěn)定性較差，在無選擇壓力下，重組質粒很容易丟失。(4)蛭石結瘤實驗表明，3株耐鹽的根瘤菌工程菌株中2764/pSZ1.5、2764/betAB能夠正常結瘤，且對植株的生長有明顯促進作用，尤其是工程菌2764/pSZ1.5。工程菌2764/pSZ1.5、2764/betAB在加入100mMNaC

6、l的情況下仍能夠結瘤，雖然結瘤量明顯減少，但出發(fā)菌株在此情況下完全不結瘤。工程菌110/pSZ1.5在正常鹽濃度及加鹽的情況下，三次重復都沒有結瘤，且對植株生長產生抑制作用。 綜合以上實驗結果，3株耐鹽的根瘤菌工程菌株應用前景是，110/pSZ1.5對植株的結瘤固氮性能及生長狀況產生抑制作用，不可以應用；2764/betAB對植株的結瘤固氮性能及生長狀況沒有影響，但穩(wěn)定性差，也達不到應用的要求；只有2764/pSZ1.5不僅對植