1,25-二羥維生素D3對(duì)免疫性血小板減少癥模型小鼠的治療作用.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察并分析1,25-二羥維生素D3對(duì)于成功建立免疫性血小板減少癥(ITP)模型的小鼠的體重、血小板計(jì)數(shù)等各方面的治療作用；以及測(cè)量小鼠骨髓來(lái)源DC細(xì)胞表面CD80，CD86，MHC II表達(dá)水平，探討1,25-二羥維生素D3治療的作用機(jī)制。為臨床上應(yīng)用1,25-二羥維生素D3治療ITP等自身免疫性疾病，提供了相關(guān)理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.豚鼠抗小鼠血小板抗血清的制備：取 BALB/c小鼠抗凝全血，分離出

2、血小板制成混懸液后分別與等量完全和不完全弗氏佐劑充分混合，分別于第0、1、2、4周注射于豚鼠背部、腹股溝及后足掌皮下免疫。第5周取豚鼠不抗凝全血，離心后獲得上清即為 GP-APS。腹腔給予BALB/c小鼠不同比例的GP-APS，觀(guān)察血小板下降幅度和持續(xù)時(shí)間，選取合適的稀釋倍數(shù)。
　　2.慢性模型的分組與建立：隨機(jī)將小鼠分為生理鹽水對(duì)照組，ITP模型組和1,25-二羥維生素D3治療組，模型組經(jīng)腹腔給予GP-APS，治療組在模型組的基

3、礎(chǔ)上經(jīng)尾靜脈注射給予100ng/d的1,25-二羥維生素D3，生理鹽水對(duì)照組均給予相同體積的生理鹽水經(jīng)腹腔及尾靜脈注射給藥。在每次給藥后24h采血，測(cè)量血小板計(jì)數(shù)，并記錄體重，評(píng)價(jià)出血傾向等。于2周后處死小鼠并解剖，取骨髓涂片，鏡下計(jì)數(shù)巨核細(xì)胞數(shù)。
　　3.細(xì)胞培養(yǎng)：隨機(jī)從治療組和模型組各取一只 BALB/c小鼠，在無(wú)菌環(huán)境下取股骨髓腔內(nèi)骨髓，收集后過(guò)濾，去除紅細(xì)胞并洗滌兩次。加入無(wú)菌完全培養(yǎng)基(其中含GM-CSF20ng/ml，

4、IL-410ng/ml，雙抗及胎牛血清)將收集的細(xì)胞重懸，并按照之前的分組移至6孔培養(yǎng)板中，做上標(biāo)記。
　　4.觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：每天將六孔板放置于倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)等變化。5.流式檢測(cè) CD86，CD80和MHC II類(lèi)分子表達(dá)：收集第7天細(xì)胞，加入PE-cy5-CD86、FITC-CD80、PE-MHCⅡ，避光條件下室溫孵育30min。洗滌兩次后重懸細(xì)胞，上機(jī)分析。
　　結(jié)果：1,25-二羥維生素D3處理后，注射

5、第10天開(kāi)始，治療組小鼠體重較模型組明顯上升(p<0.05)，血小板數(shù)較模型組明顯上升(p<0.01)，出血傾向明顯降低(x2<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1,25-(OH)2D3治療組的DC細(xì)胞表面CD86和MHC II表達(dá)水平較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；CD80的表達(dá)有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.1,25-(OH)2D3對(duì)ITP模型小鼠在體重飲食等一般情況、