膽汁性肝硬化大鼠腎臟組織的HO-1的表達(dá)和腎細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、肝硬化腎功能損害是肝硬化患者死亡的主要原因之一，表現(xiàn)為自發(fā)性少尿或無尿、氮質(zhì)血癥、稀釋性低血鈉和低尿鈉等。肝硬化時(shí)。腎功能損害的原因未明，可能是由于嚴(yán)重肝功能障礙導(dǎo)致腎臟的血流動(dòng)力學(xué)改變所致，其腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變的特征是：腎內(nèi)血管收縮，腎血流重新分布，血流自腎皮質(zhì)向髓質(zhì)分流，腎皮質(zhì)缺血，腎小球入球小動(dòng)脈收縮，腎小球?yàn)V過率下降。盡管此時(shí)體循環(huán)擴(kuò)血管因子可因過度產(chǎn)生和滅活障礙而升高，但腎臟縮血管因子活性卻占優(yōu)勢(shì)。因此，隨著肝硬化病程加重，腎

2、血管收縮逐漸加劇，腎血管阻力增加，導(dǎo)致腎血流灌注量和腎小球?yàn)V過率降低，最終導(dǎo)致進(jìn)行性少尿、無尿、血肌酐和尿素氮水平升高，從而發(fā)生肝腎綜合征(Hepatorenal syndrome，HRS)。 近年研究發(fā)現(xiàn)一氧化碳(Carbon monoxide,CO)同一氧化氮(Nitric oxide,NO)一樣，也是一種重要的氣體信號(hào)分子，除參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)傳遞外，它在血管張力調(diào)節(jié)中也起重要作用。這一發(fā)現(xiàn)提示我們研究一氧化碳是否也參

3、與了肝硬化時(shí)。腎臟血管的調(diào)節(jié)。HO是血紅素分解代謝的限速酶，催化血紅素轉(zhuǎn)化成為等分子量的膽綠素、一氧化碳和游離鐵。 自從1972年Kerr首次提出凋亡的概念，對(duì)凋亡的研究得到了廣泛、深入的發(fā)展。凋亡系形態(tài)學(xué)現(xiàn)象，具有特異性的形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為細(xì)胞核，包括染色質(zhì)密集于皺縮的核膜下呈邊緣化，胞核高度凝集致密，晚期染色體斷裂，核碎裂，直至形成凋亡小體。從基因角度看凋亡受到各種基因調(diào)節(jié)，例如：asp53，c-myc,Bcl-2等。Bcl

4、-2和Bax同屬于一個(gè)家族，Bcl-2抑制凋亡的發(fā)生，Bcl-2受Bax的影響，Bcl-2過表達(dá)抑制凋亡的發(fā)生，Bax過表達(dá)促進(jìn)凋亡的發(fā)生。 目的：本實(shí)驗(yàn)采用膽總管結(jié)扎(common Bile ductligation,CBDL)制備膽汁性肝硬化大鼠模型，觀察膽汁性肝硬化腎臟的病理變化，檢測(cè)腎組織中HO-1的表達(dá)與定位，腎組織中丙二醛含量的變化以及腎臟凋亡情況，并同時(shí)檢測(cè)和凋亡有關(guān)的腎組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平。旨在探討

5、肝硬化進(jìn)程中。腎臟的損傷情況，及其在HRS發(fā)生機(jī)制中的作用。 方法：采用Sprague-Dawley大鼠，CBDL方法制備動(dòng)物模型，共30只。隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham operation，so)、2周組(2 wk)和5周組(5 wk)。采用病理染色觀察肝硬化形成情況，病理及電鏡觀察相對(duì)應(yīng)的腎臟組織學(xué)改變；應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察HO-1蛋白在腎臟的表達(dá)和分布；留取大鼠24小時(shí)尿及術(shù)中采集靜脈血檢測(cè)血肌酐，并計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率；應(yīng)用

6、分光光度比色法檢測(cè)腎組織丙二醛(MDA)含量；應(yīng)用原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)(in situ end labellingtechnique,ISEL)即TUNEL法檢測(cè)腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。免疫組化法檢測(cè)腎組織Bcl-2,Bax蛋白表達(dá)水平，病理圖象分析系統(tǒng)處理切片染色結(jié)果。 結(jié)果：病理觀察顯示CBDL大鼠2 wk時(shí)肝纖維化形成，5wk時(shí)肝硬化形成。在2wk及5wk各組大鼠肌酐清除率逐漸降低(P<0.05)。CBDL大鼠5wk時(shí)

7、腎組織光鏡病理切片HE染色顯示，腎小管上皮細(xì)胞有脫落、壞死現(xiàn)象；電鏡顯示基底膜不規(guī)則增厚，系膜區(qū)增寬，上皮細(xì)胞足突融合。在5 wk組大鼠腎臟HO-1陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞漿內(nèi)黃染顆粒減少，陽性面積(12.90±3.90)明顯低于2wk組(60.47±1.78，P=0.00)和假手術(shù)組(53.04±12.79，P=0.00)，而假手術(shù)組與2wk組大鼠無明顯差異(P=0.122)。腎組織MDA測(cè)定結(jié)果顯示，5wk組(4.07±0.51)較2wk組

8、(2.32±0.85，P=0.00)和假手術(shù)組(0.79±0.37，P=0.00)數(shù)值有升高，2wk組較假手術(shù)組有升高(P=0.00)，表明隨著大鼠肝硬化進(jìn)展腎組織MDA含量逐漸增加。腎組織經(jīng)TUNEL染色后，可見凋亡細(xì)胞簇狀堆積，核膜變厚，染色質(zhì)固縮或呈塊狀堆積于核膜邊緣，有的腎小管甚至出現(xiàn)壞死、脫落和細(xì)胞聚集現(xiàn)象。5wk組腎組織凋亡細(xì)胞明顯增多，凋亡面積(68.36±8.71)顯著性高于2wk組(24.08±2.59，P=0.00)

9、和假手術(shù)組(11.43±2.77，P=0.00)，2wk組和假手術(shù)組比較有差異(P=0.00)。免疫組化顯示假手術(shù)組，Bcl-2表達(dá)相對(duì)灰度值為1.36±0.19，Bax為1.23±0.15；2wk組Bcl-2表達(dá)相對(duì)灰度值為1.08±0.09，Bax為1.50±0.19；5wk組Bcl-2表達(dá)相對(duì)灰度值為0.75±0.13，Bax為1.80±0.10。Bcl-2與Bax表達(dá)分別呈下降和上升趨勢(shì)，進(jìn)一步證明凋亡存在并于凋亡基因的激活與抑

10、制有關(guān)。從MDAN定值與凋亡面積的相關(guān)分析看，兩者呈正相關(guān)，假手術(shù)組(r=0.9410)，P<0.05：2wk組(r=0.9113，P<0.05)；5wk組(r=0.8851，P<0.01)。 結(jié)論： 1 CBDL CBDL大鼠隨著肝硬化的進(jìn)展腎臟有病理組織學(xué)改變，大鼠的腎臟組織病理學(xué)改變隨著肝硬化病程的進(jìn)展而加重。 2 CBDL大鼠腎組織HO-1蛋白表達(dá)隨著肝硬化病變加重而減少，并伴有腎功能逐漸減退與腎血流量