真核翻譯起始因子3第4亞單位（eIF3g）在腫瘤細(xì)胞多藥耐藥中的作用.pdf

1、腫瘤細(xì)胞的耐藥現(xiàn)象尤其是多藥耐藥(multidrug resistante,MDR)是導(dǎo)致臨床化療失敗的重要因素之一.迄今人們已從很多方面對腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制進(jìn)行了大量研究,如P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)等ATP結(jié)合型(ATP bindingcassette,ABC)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對藥物外排而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物

2、的有效濃度降低、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶類(glutathione S transferase,GST)對細(xì)胞內(nèi)藥物的解毒、DNA拓?fù)涿割?DNA topoisomerase)的表達(dá)及活性降低使細(xì)胞對藥物的敏感性改變、細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)機(jī)制的影響以及細(xì)胞色素P450等(cytochrome P450)表達(dá)下降使其對藥物的活化作用下降等.另外許多研究還表明,細(xì)胞內(nèi)HSPTO等應(yīng)激蛋白的表達(dá)升高一類的抗凋亡因素也與腫瘤細(xì)胞耐藥有關(guān).這些耐藥機(jī)制的發(fā)

3、現(xiàn)與研究都給臨床問題的解決提供了清晰的思路和明確的靶點(diǎn),并已有了一些針對性措施,而且也收到了相應(yīng)的療效,如針對P-gp的一種MDR逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米(verapamil),可以有效地抑制P-pg介導(dǎo)的藥物外排而使高表達(dá)P-gp的腫瘤細(xì)胞對化療藥物變得敏感.但是腫瘤細(xì)胞的耐藥是由眾多因素影響的,原因十分復(fù)雜,而人們對這些因素的認(rèn)識遠(yuǎn)未達(dá)到全面的程度,因此仍無法完全解決臨床腫瘤耐藥問題.人們?nèi)栽趶母鱾€(gè)方面對腫瘤耐藥機(jī)制進(jìn)行更多的探索性研究,如整

4、合素(integrin)和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)相互作用導(dǎo)致的MDR現(xiàn)象.因此,探尋更多的腫瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)因素,全面透徹地闡明耐藥的機(jī)制,可以使我們有更多的、更有效的解決臨床化療耐藥問題的手段,具有十分重要的理論和臨床應(yīng)用意義. 為了從整體水平尋找新的腫瘤細(xì)胞耐藥/MDR相關(guān)因素,我們課題組在前期工作中,模擬臨床狀態(tài),將人白血病細(xì)胞株K562培養(yǎng)于含阿霉素(adriamycin,ADR)的

5、培養(yǎng)液中,通過長時(shí)間遞增劑量ADR的誘導(dǎo),成功地獲得了穩(wěn)定的具有MDR表型的多藥耐藥系K562/ADR,至今已六年余.該細(xì)胞系可常規(guī)培養(yǎng)于含有ADR的培養(yǎng)液中,與對藥物敏感的母細(xì)胞株K562相比,K562/ADR對ADR的耐受性增加了約149倍;對長春新堿的耐受性增加了200倍以上.在此基礎(chǔ)上,我們運(yùn)用了蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析,研究了Ka62/ADR細(xì)胞和K562細(xì)胞在蛋白質(zhì)表達(dá)上的差異.蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜表明,K562/ADR

6、細(xì)胞與K562細(xì)胞相比,既有一些蛋白質(zhì)表達(dá)的明顯的量上的差異,又有一些蛋白質(zhì)從無到有或從有到無的表達(dá)改變,這些蛋白質(zhì)表達(dá)情況的變化,是人白血病細(xì)胞K562從對藥物敏感到接觸到化療藥物ADR后產(chǎn)生多藥耐藥特性這一變化中細(xì)胞內(nèi)一系列分子事件的直接體現(xiàn),是MDR表型產(chǎn)生的分子基礎(chǔ).我們對其中一個(gè)在K562細(xì)胞中無表達(dá)、但在K562/ADR細(xì)胞中大量表達(dá)(考馬斯亮藍(lán)染色和銀染)的蛋白質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步的串聯(lián)質(zhì)譜(MS-MS)分析,鑒定為真核翻譯起始

7、因子3第4亞基(eukaryotic translation initiation factor 3 subunit 4,eIF3g),根據(jù)國際命名規(guī)則為eIF3g. eIF-3是最大最復(fù)雜的真核翻譯起始因子,包含至少12個(gè)亞單位,有a(p170,p150,eIF3s10)、b(p116,eIF3s9)、c(p110)、d(p66,eIF3s7)、e(p48,int6)、f(p47)、g(p44,p42,eIF3g)、h(p40

8、,eIF3s3)、i(p36)、j(p35,eIF3s1)、k(p28)、1(p69)等.在翻譯起始過程中,eIF-3在形成43S起始前復(fù)合物(preinitiationcomplex)及引導(dǎo)mRNA正確結(jié)合中起協(xié)調(diào)作用.但到目前為止,對eIF3的各個(gè)蛋白亞單位的具體功能還未完全了解. 已有的研究表明,在人乳腺癌,子宮頸癌,胃癌,食道癌和肺癌中,eIF-3最大的一個(gè)亞單位eIF3a/p170/p150的表達(dá)顯著提高,表達(dá)水平與臨

9、床病理類型相關(guān),并且其高表達(dá)可能是一個(gè)惡變早期的指標(biāo),并可能在癌細(xì)胞的生長、惡性生物學(xué)行為的維持上起重要的作用.eIF-3的另一個(gè)亞單位eIF3h/p40在一些前列腺癌和原發(fā)性乳腺癌中也呈現(xiàn)出高表達(dá)的情況.而eIF3e/int6也被認(rèn)為可作為判斷非小細(xì)胞肺癌中病人預(yù)后的一個(gè)指標(biāo).更重要的一個(gè)發(fā)現(xiàn)是,在對模式生物酵母菌的研究中有跡象表明eIF3的一個(gè)蛋白亞單位eIF3e/int6在真核細(xì)胞的耐藥中發(fā)揮了作用. 本課題的研究對象是e

10、IF3的另一個(gè)亞單位eIF3g，目前人們除了對它在翻譯起始過程中的作用有少量的了解，尚未有文獻(xiàn)報(bào)道其與包括腫瘤在內(nèi)的任何人類疾病相關(guān)。為了研究eIF3g與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥之間的關(guān)系，本課題克隆了eIF3g全長編碼區(qū)cDNA,構(gòu)建了eIF3g原核細(xì)胞GST融合蛋白表達(dá)載體，回收了融合蛋白作為抗原制備多克隆抗體;構(gòu)建了(His)a-eIF3g表達(dá)載體，并在Bcap37細(xì)胞得到穩(wěn)定表達(dá);構(gòu)建了 EGFP-eIF3g表達(dá)載體，觀察了eIF3g的