中國科考隊員赴南級前后外周血淋巴細(xì)胞生物鐘基因Clock和Bmall晝夜節(jié)律性轉(zhuǎn)錄解析.pdf

1、人和動物的生理機(jī)能、生化代謝、行為表現(xiàn)等常以24 h為周期發(fā)生規(guī)律性變動，這種變化的節(jié)律稱為晝夜節(jié)律。產(chǎn)生晝夜節(jié)律的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是分子計時器-晝夜節(jié)律生物鐘(circadian clock)。對于主導(dǎo)節(jié)律調(diào)節(jié)的一些重要基因，稱之為生物鐘基因。機(jī)體的各種內(nèi)在晝夜節(jié)律性變化可在外界環(huán)境因素的作用下得到重設(shè)性調(diào)節(jié)，以使機(jī)體活動與環(huán)境變化達(dá)成和諧統(tǒng)一。
　　 引發(fā)和調(diào)控晝夜節(jié)律生物鐘的分子機(jī)制是在鐘輸入信號(如光照、溫度等)的作用下，若干鐘

2、基因、鐘相關(guān)基因和鐘控基因及其蛋白產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)錄-翻譯-翻譯后事件的相互銜接，組成鐘振蕩器的自身調(diào)控反饋環(huán)路，實(shí)現(xiàn)鐘信號的精確輸出。其中作為環(huán)路中正向調(diào)節(jié)成分的核心鐘基因Clock和Bmal1，已被證實(shí)不但24h節(jié)律性表達(dá)于中樞鐘組織如視交叉上核與松果體，而且也表達(dá)于包括血細(xì)胞在內(nèi)的各種外周鐘組織。上述基因產(chǎn)物以雜二聚體形式形成正向轉(zhuǎn)錄因子，與下游鐘基因Per(Period)、Cry(Cryptochromes)或tim(Timeless

3、)啟動子區(qū)的E-box元件結(jié)合，激活一系列基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，因此，Clock和Bmal1在生物鐘的分子振蕩機(jī)制中被認(rèn)為起著極其重要的作用。然而，有關(guān)人外周血淋巴細(xì)胞核心鐘基因Clock和Bmal1的晝夜節(jié)律性轉(zhuǎn)錄在南極大陸特殊環(huán)境下有著怎樣的表現(xiàn)，至今未明，這正是本文所要探討的內(nèi)容。
　　 目的：
　　 探討赴南極前后科考隊員外周血淋巴細(xì)胞核心鐘基因Clock和Bmal1的晝夜節(jié)律性表達(dá)規(guī)律，旨在解析、拓展特殊環(huán)境下人類

4、外周免疫鐘運(yùn)行的分子調(diào)控機(jī)制。
　　 方法：
　　 8名健康、男性中國南極科考隊員志愿者，年齡24～30歲，平均25歲。赴南極前在晝夜節(jié)律模式條件(自然光制，16 h-light：8 h-dark cycle，LD)下生活1周：室溫25±1℃，起床時間：7:00，睡眠時間(無光照期)：23:00～7:00，早餐時間：7:30～8:00，午餐時間：11:30～12:00，晚餐時間：5:30～6:00；睡眠時光照強(qiáng)度<0.1

5、 Lux；受試者自由飲水，無煙酒嗜好，在過去6個月內(nèi)未做過跨時區(qū)旅行和未接受過藥物治療，日?；顒雍惋嬍吵煞只疽恢?。隨后在一晝夜內(nèi)，隨機(jī)選擇2位受試者，每隔4 h抽取各自外周血6 ml，血樣采集在4個不連續(xù)的隨機(jī)晝夜內(nèi)完成。分離其淋巴細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時熒光定量PCR方法，測定不同晝夜時點(diǎn)(zeitgeber time，ZT，共6個，每個時點(diǎn)n=8)每個樣品中Clock和Bmal1基因的mRNA表達(dá)量，并以熔解

6、曲線和凝膠電泳條帶加以驗證，通過余弦法和ClockLab軟件獲取節(jié)律參數(shù)，并經(jīng)振幅F檢驗分析是否存在晝夜節(jié)律性表達(dá)。
　　 選取相同8名男性科考隊員，赴南極后生活一年，經(jīng)歷了極晝與極夜光照差異、季節(jié)與氣候差異、氣溫與氣壓差異等自然環(huán)境變化。其晝夜模式生活條件、采血方式、取樣時間、實(shí)驗檢測方法及數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理同上。
　　 結(jié)果：
　　 1.科考隊員赴南極前外周血淋巴細(xì)胞核心鐘基因Clock和Bmal1的晝夜表達(dá)

7、r>　　 1.1在LD(16:8)光制下，科考隊員外周血淋巴細(xì)胞鐘基因Clock和Bmal1的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律性振蕩(振幅F檢驗，P<0.05)；
　　 1.2 Clock基因的峰值相位-335.85±13.80，表達(dá)振幅3.46±1.27，中值-11.40±1.59，峰時和谷時分別位于ZT22和ZT10，峰時與谷時mRNA水平分別為-7.95±2.55和-14.85±1.32；
　　 1.3 Bmal1

8、基因的峰值相位-307.12±108.17，表達(dá)振幅2.77±1.11，中值-5.50±1.32，峰時和谷時分別位于ZT20和ZT8，峰時與谷時mRNA水平分別為-2.74±0.71和-8.25±2.33；
　　 1.4 Clock和Bmal1晝夜節(jié)律性轉(zhuǎn)錄的比較：兩個基因LD(16:8)光制下在所檢測的6個晝夜時點(diǎn)中表達(dá)水平均有明顯差異(P<0.05)，Clock基因的表達(dá)水平較Bmal1基因降低；從晝夜節(jié)律性參數(shù)比較看出，兩

9、個基因表達(dá)的峰值相位、振幅無差異(P>0.05)，而Clock基因轉(zhuǎn)錄的中值水平以及峰時mRNA水平和谷時mRNA水平均降低(P<0.05)，Clock峰時和谷時比Bmal1推后約2小時(P<0.05)。
　　 2.科考隊員赴南極后外周血淋巴細(xì)胞核心鐘基因Clock和Bmal1的晝夜表達(dá)
　　 2.1八名科考隊員中分別有2人鐘基因Clock、3人Bmal1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有明顯的晝夜節(jié)律性(振幅F檢驗，P<0.05)；

10、>　　 2.2二人Clock基因的峰值相位-42.28±5.27，表達(dá)振幅0.79±0.29，中值-9.02±0.24，峰時和谷時分別位于ZT3和ZT15，峰時與谷時mRNA水平分別為-8.23±0.53和-9.81±0.05；
　　 2.3三人Bmal1基因的峰值相位-184.58±29.58，表達(dá)振幅1.04±0.65，中值-8.50±0.45，峰時和谷時分別位于ZT12和ZT24，峰時與谷時mRNA水平分別為-7.46±

11、0.41和-9.54±1.04；
　　 2.4 Clock和Bmal1晝夜節(jié)律性轉(zhuǎn)錄的比較：存在晝夜節(jié)律性表達(dá)的兩個基因[Clock(n=2)和Bmal1(n=3)]在所檢測的6個晝夜時點(diǎn)(除了ZT14)的表達(dá)水平及其晝夜節(jié)律性參數(shù)變化均無顯著性差異(P>0.05)：
　　 2.5其他隊員的上述兩個基因不表現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律性轉(zhuǎn)錄特征(振幅F檢驗，P>0.05)。這些無節(jié)律表達(dá)隊員的Clock基因，除晝夜時點(diǎn)ZT22以外，

12、在其它各時點(diǎn)的表達(dá)量均低于Bmal1基因(P<0.05)。
　　 3.科考隊員赴南極前、后外周血淋巴細(xì)胞核心鐘基因Clock和Bmal1晝夜節(jié)律性轉(zhuǎn)錄的比較
　　 3.1赴南極前、后鐘基因Clock晝夜節(jié)律性表達(dá)的比較：赴南極后的Clock晝夜節(jié)律性表達(dá)，與赴南極前相比，除晝夜時點(diǎn)ZT18和ZT22以外，在其它時點(diǎn)的表達(dá)量均上調(diào)(P<0.05)。隊員赴南極后Clock基因的節(jié)律性表達(dá)振幅減小、中值增大、谷時mRNA水平增

13、大(P<0.05)，峰時和谷時分別推遲約5個小時。
　　 3.2赴南極前、后鐘基因Bmal1晝夜節(jié)律性表達(dá)的比較：赴南極后的Bmal1晝夜節(jié)律性表達(dá)，與赴南極前相比，除晝夜時點(diǎn)ZT10和ZT14以外，在其它時點(diǎn)的表達(dá)量均下調(diào)(P<0.05)。隊員赴南極后Bmal1基因的節(jié)律性表達(dá)峰值相位推后，振幅、中值和峰時mRNA水平均下降(P<0.05)，峰時和谷時分別推遲約16個小時。
　　 結(jié)論：
　　 1.赴南極前，在

14、LD(16:8)自然光制下，科考隊員外周血淋巴細(xì)胞核心生物鐘基因Clock和Bmal1的轉(zhuǎn)錄具有明顯的晝夜節(jié)律性振蕩特征；Clock轉(zhuǎn)錄的峰時和谷時分別位于ZT22和ZT10，Bmal1的峰時和谷時分別位于ZT20和ZT8；Clock基因各晝夜時點(diǎn)的表達(dá)水平、中值以及峰時mRNA水平和谷時mRNA水平較Bmal1基因的降低，Clock峰時和谷時比Bmal1推后約2小時。
　　 2.赴南極后，經(jīng)歷各種自然環(huán)境變化，相同8名隊員中多

15、數(shù)人上述兩個基因不再表現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律性轉(zhuǎn)錄特征，Clock基因除晝夜時點(diǎn)ZT22以外，在其它各時點(diǎn)的表達(dá)量均低于Bmal1基因。
　　 3.赴南極后，2人Clock基因、3人Bmal1基因的轉(zhuǎn)錄繼續(xù)維持明顯的晝夜節(jié)律性表達(dá)，其中Clock轉(zhuǎn)錄的峰時和谷時分別位于ZT3和ZT15，Bmal1的峰時和谷時分別位于ZT12和ZT24；兩個基因在所檢測的6個晝夜時點(diǎn)(ZT14除外)的表達(dá)水平及其晝夜節(jié)律性參數(shù)的相應(yīng)變化基本一致。