中華大蟾蜍(Bufo bufo gargarigans)生物鐘基因表達(dá)及外周激素水平的晝夜節(jié)律研究.pdf

1、目前為止，維持生物鐘運(yùn)行的確切分子調(diào)控過(guò)程仍然不夠清楚，而且存在較大的種屬差異。對(duì)分子鐘系統(tǒng)的研究主要集中在嚙齒類(lèi)和魚(yú)類(lèi)的模式物種，只有少量關(guān)于兩棲類(lèi)和爬行類(lèi)的研究。由于兩棲動(dòng)物是由水生到陸生進(jìn)化過(guò)程中的過(guò)渡類(lèi)群，其在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)中占有重要位置，因此研究?jī)蓷珓?dòng)物能使我們更深刻地理解脊椎動(dòng)物的晝夜節(jié)律系統(tǒng)。然而，迄今為止關(guān)于兩棲類(lèi)生物鐘系統(tǒng)的基本知識(shí)還非常缺乏。
　　因此，本研究以中華大蟾蜍為研究對(duì)象，克隆了分子鐘系統(tǒng)的核心鐘基因cD

2、NA片段，包括正性調(diào)控元件Clock和Bmal1以及負(fù)性調(diào)控元件Cry(Cry1和Cry2)和Per（Per1和Per2），探究該物種在人工授時(shí)環(huán)境下生物鐘基因的節(jié)律表達(dá)與外周激素水平節(jié)律的關(guān)系。這些激素包括:(1)生物鐘最重要的節(jié)律輸出信號(hào)—褪黑素(MT)(2)可反映動(dòng)物行為和應(yīng)激狀態(tài)的糖皮質(zhì)激素—皮質(zhì)酮(CORT)(3)能夠反映機(jī)體代謝水平的甲狀腺激素（T3和T4）。另外，還克隆了甲狀腺激素受體β。
　　主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:

3、r>　　(1)中華大蟾蜍在12L∶12D光周期條件下，神經(jīng)視網(wǎng)膜組織的生物鐘基因表達(dá)模式:蟾蜍視網(wǎng)膜上的Clock基因的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律模式(SE(A)/A＜0.3），雖然Bmal1的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)上未呈現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律模式(SE(A)/A＞0.3）,但其表達(dá)模式與Clock類(lèi)似，兩者峰值出現(xiàn)在ZT4;Per1的表達(dá)呈現(xiàn)出顯著的24 h晝夜節(jié)律(SE(A)/A＜0.3），其波峰值出現(xiàn)在黑暗期ZT20，而Per2基因的表達(dá)的節(jié)律性在

4、統(tǒng)計(jì)上并不顯著(SE(A)/A＞0.3），且與Per1表現(xiàn)出相反的晝夜反應(yīng)模式;Cry1和Cry2基因的表達(dá)模式均未呈現(xiàn)出顯著的節(jié)律性(SE(A)/A＞0.3），兩者在黑暗期表達(dá)水平要略高于光照期，在趨勢(shì)上似乎具有一定的同步性。
　　(2)中華大蟾蜍在12L∶12D光周期條件下，腦組織的生物鐘基因表達(dá)模式:蟾蜍腦組織內(nèi)Clock和Bmal1的表達(dá)均具有明顯的晝夜節(jié)律(SE(A)/A＜0.3），兩者在光照啟動(dòng)后4 h(ZT4)同時(shí)達(dá)

5、到峰值(P＜0.05)，在黑暗期ZT16同時(shí)降至谷值(P＜0.05); Per1和Per2表達(dá)均呈現(xiàn)出顯著的晝夜節(jié)律(SE(A)/A＜0.3），Cry1表達(dá)也具有明顯的晝夜節(jié)律(SE(A)/A＜0.3），但Cry2表達(dá)在統(tǒng)計(jì)上沒(méi)有明顯的晝夜節(jié)律(SE(A)/A＜0.3），腦組織內(nèi)Cry1與Per1、Cry2與Per2的表達(dá)呈現(xiàn)出明確的趨同性。
　　(3)中華大蟾蜍血漿中激素水平的晝夜節(jié)律變化:蟾蜍血漿中MT存在一個(gè)明顯的24h晝夜

6、節(jié)律(SE(A)/A＜0.3），在黑暗前夕(ZT12)時(shí)達(dá)到峰值(P＜0.05)，在臨近光照前(ZT24)降至谷值（P＜0.05）;大蟾蜍血漿皮質(zhì)酮水平呈現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律模式(SE(A)/A＜0.3），當(dāng)光啟動(dòng)后第4 h(ZT4)血漿皮質(zhì)酮水平達(dá)到峰值（P＜0.05），然后在光照結(jié)束前后顯著降低(P＜0.05)，隨后在黑暗期呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)(P＞0.05);蟾蜍神經(jīng)視網(wǎng)膜和腦組織內(nèi)THRβ基因mRNA表達(dá)在統(tǒng)計(jì)上均未呈現(xiàn)出顯著的節(jié)律