生物鐘CLOCK蛋白對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及功能影響.pdf

1、第一部分:生物鐘CLOCK蛋白對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用
　　目的:研究生物鐘CLOCK蛋白可與哪些動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的標(biāo)準(zhǔn)E-box或E-box-like元件結(jié)合，確定哪些動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因?qū)儆阽娍鼗?clock controlled genes, ccgs)。
　　方法:
　　1.在PubMed中查找分析動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因上游-2kb啟動(dòng)子區(qū)域的E-box或E-box-like元件，采用

2、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation，ChIP)，確定哪些動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因可能受到CLOCK蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，屬于鐘控基因。Ⅳ膠原酶灌注法培養(yǎng)原代C57BL/6J小鼠肝細(xì)胞。
　　2.合成小鼠clock基因小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）及構(gòu)建小鼠clock基因過表達(dá)腺病毒載體，分別轉(zhuǎn)染C57BL/6J小鼠肝細(xì)胞，48小時(shí)后，通過Realtime

3、PCR測定clock基因抑制或過表達(dá)后，動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因（ChIP實(shí)驗(yàn)篩選出的CLOCK蛋白的靶基因）的mRNA表達(dá)水平變化。
　　3.原代培養(yǎng)CLOCK mutant小鼠和C57BL/6J小鼠肝細(xì)胞，通過Realtime PCR測定動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因（ChIP實(shí)驗(yàn)篩選出的CLOCK蛋白的靶基因）mRNA表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果:
　　1.通過ChIP證實(shí)CLOCK蛋白與LIF(leukemia inhibito

4、ry factor)、ICAM-1、ADFP(adipose differentiation-related protein)、NF-κB1基因（編碼p105 NF-κB亞單位）啟動(dòng)子的結(jié)合能力分別是陰性對(duì)照組的2.58倍、3.48倍、2.45倍、2.27倍。
　　2.與negative-control siRNA組相比，C57BL/6J小鼠肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染clock-siRNA48小時(shí)后clock基因mRNA表達(dá)水平下降81％， LI

5、F、NF-κB1、ADFP、ICAM-1的mRNA表達(dá)水平均下降，分別下降31.6％、40.5％、10％、41.8％。與GFP對(duì)照組相比，小鼠clock過表達(dá)腺病毒感染C57BL/6J小鼠肝細(xì)胞48小時(shí)后，clock基因mRNA表達(dá)水平增加201倍，ADFP、ICAM-1基因mRNA表達(dá)水平分別增加2.03倍、2.81倍;LIF、NF-κB1基因的mRNA表達(dá)水平變化不明顯。
　　3.與C57BL/6J小鼠相比，CLOCK mut

6、ant小鼠肝細(xì)胞中LIF、NF-κB1、ADFP、ICAM-1的mRNA表達(dá)水平顯著下降，分別下降46.9％、52％、16.7％、45.7％。
　　結(jié)論:
　　1.首次證實(shí)生物鐘CLOCK蛋白可與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因LIF、NF-κB1、ADFP、ICAM-1基因含有E-box或E-box-like元件的啟動(dòng)子序列結(jié)合。
　　2.抑制小鼠肝細(xì)胞clock基因表達(dá)以及CLOCK mutant小鼠肝細(xì)胞中，LIF、NF-κ

7、B1、ADFP、ICAM-1的mRNA表達(dá)水平明顯下降。
　　3.提示LIF、NF-κ B1、ADFP、ICAM-1基因可能是鐘控基因。
　　第二部分:生物鐘CLOCK蛋白對(duì)ICAM-1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用及對(duì)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞粘附功能的影響
　　目的:明確生物鐘CLOCK蛋白對(duì)ICAM-1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，探討CLOCK對(duì)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞粘附功能的影響。
　　方法:
　　1.利用pGL3-Promoter Lucif

8、erase Reporter Vector，構(gòu)建小鼠ICAM-1基因含有E-box-like元件（CAAGTG， from-584 to-579）的啟動(dòng)子序列(from-729 to-329)報(bào)告基因。小鼠ICAM-1報(bào)告基因重組質(zhì)粒與clock-siRNA或negative control siRNA共轉(zhuǎn)染C57BL/6J小鼠肝細(xì)胞，48小時(shí)后測定熒光素酶活性。
　　2.將clock-siRNA或negative control

9、-siRNA轉(zhuǎn)染至小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3細(xì)胞，24小時(shí)后，通過Realtime PCR測定clock基因表達(dá)下調(diào)后動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因（ChIP篩選出的CLOCK蛋白的靶基因）的mRNA表達(dá)水平變化。
　　3.將clock-siRNA或negative control siRNA轉(zhuǎn)染bEnd.3細(xì)胞。48小時(shí)后，以細(xì)胞粘附試驗(yàn)測定clock基因表達(dá)下調(diào)后bEnd.3細(xì)胞粘附功能的改變，并通過Realtime PCR測定粘附

10、相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建小鼠ICAM-1基因含有E-box-like元件的啟動(dòng)子序列報(bào)告基因。小鼠ICAM-1報(bào)告基因重組質(zhì)粒與clock-siRNA或共轉(zhuǎn)染C57BL/6J小鼠肝細(xì)胞，與negative control siRNA組相比，clock基因表達(dá)下調(diào)后熒光素酶活性下降61.5％。
　　2.與negative control siRNA組相比，Clock-siRNA轉(zhuǎn)染bE

11、nd.3細(xì)胞24小時(shí)后，clock基因mRNA表達(dá)水平下降54.33％，ICAM-1、LIF、NF-κB1、ADFP的mRNA表達(dá)水平均下降，分別下降34.43％、38％、26％、8％。
　　3.與negative control siRNA組相比，Clock-siRNA轉(zhuǎn)染bEnd.3細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞粘附功能下降41.7％，粘附相關(guān)基因VCAM-1、CCL-2、CCL-5的mRNA表達(dá)水平分別下降21.7％、27.4％、19