短發(fā)夾RNA干擾表達(dá)質(zhì)粒與防粉已堿對(duì)大腸癌細(xì)胞LOVO-5-Fu多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)作用的比較.pdf

1、目的:大腸癌是一種常見惡性腫瘤，大腸癌病死率在西方國(guó)家位于惡性腫瘤死亡的第3位，僅次于肺癌和乳腺癌，在我國(guó)占惡性腫瘤死因的第5位，且發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)。早、中期大腸癌以手術(shù)治療為主，晚期及術(shù)后復(fù)發(fā)患者，其主要治療手段則為化療。但是目前化療療效并不樂觀，大腸癌化療療效顯著降低的主要原因之一是由于腫瘤多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)的產(chǎn)生，尤其是大腸癌細(xì)胞的MDR原發(fā)性高表達(dá)及繼發(fā)性高表達(dá)。MDR的特點(diǎn)是一旦

2、對(duì)某種化療藥物產(chǎn)生耐藥，則對(duì)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制均不同的抗癌藥物都可產(chǎn)生交叉、廣譜的耐藥現(xiàn)象[1]。本研究通過(guò)比較短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)干擾表達(dá)質(zhì)粒與防粉己堿(Tetrandrine，Tet)對(duì)大腸癌LOV0/5-Fu細(xì)胞株MDRlmRNA的表達(dá)、P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的表達(dá)、對(duì)細(xì)胞周期和凋亡率的影響、以及對(duì)化療藥物敏感性的影響，探討shRNA干擾質(zhì)粒和Tet

3、大腸癌LOV0/5-Fu耐藥細(xì)胞株的耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用，以期找到一種逆轉(zhuǎn)策略能更好的逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的MDR，以指導(dǎo)臨床用藥。
　　 方法靶向MDR1的shRNA干擾質(zhì)粒和Tet分別作用于人大腸癌多藥耐藥細(xì)胞株LOV0/5-Fu，噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)各組細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化、凋亡情況及P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime-PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞M

4、DRl mRNA的表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞P-gp的表達(dá)水平，并分析各組結(jié)果之間的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。
　　 結(jié)果:
　　 1、兩種干擾因素作用后細(xì)胞對(duì)5-FU敏感性的變化：轉(zhuǎn)染組[IC50=(2.38±0.45)mol/ml]比對(duì)照組[IC50=(7.27±0.34)mol/ml]的IC50顯著降低(P＜0.05)，相對(duì)逆轉(zhuǎn)率為72.7％;Tet作用組[IC50=(4.4

5、1±0.72)mol/ml]比對(duì)照組的IC50也明顯降低，(P＜0.05)，相對(duì)逆轉(zhuǎn)率42.5％。轉(zhuǎn)染組和Tet作用組均低于對(duì)照組對(duì)5-Fu的RI。表明shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞和Tet作用后均在一定程度恢復(fù)耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物5-FU的敏感性，且shRNA干擾質(zhì)粒對(duì)LOV0/5-Fu耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用更強(qiáng)。
　　 2、細(xì)胞周期的變化：與對(duì)照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染組和Tet作用組細(xì)胞G1期增多(P＜0.05)，S期減少(P＜0.05)。提

6、示抑制MDR1的表達(dá)后，更多的細(xì)胞被阻滯在G1期，進(jìn)入分裂期的細(xì)胞明顯減少，轉(zhuǎn)染組阻滯效果更明顯。
　　 3、各組細(xì)胞凋亡率的變化：對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為(1.32±0.47)％，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率為(5.88±0.44)％，兩組凋亡率間差異有顯著性意義(P＜0.05)；Tet作用組細(xì)胞的凋亡率為(3.24±0.26)％，與對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率間差異有顯著性意義(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染組與Tet作用組細(xì)胞間的凋亡率差異有顯著性意義(P

7、＜0.05)。
　　 4、P-gp表達(dá)結(jié)果：轉(zhuǎn)染組細(xì)胞P-gp[(61.6±4.85)％]明顯低于對(duì)照組細(xì)胞的P-gp的表達(dá)率[(96.9±2.25)％]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Tet作用組細(xì)胞P-gp表達(dá)率為(76.6±3.62)％，明顯低于對(duì)照組細(xì)胞的P-gp的表達(dá)率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染組與Tet作用組細(xì)胞間的P-gp表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5、細(xì)胞MDR1

8、基因的表達(dá)：轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的RQ(Relative Quantitation)值為(232.98±81.04)，與對(duì)照組細(xì)胞(1462.00±161.17)相比，MDR1表達(dá)量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Tet作用組細(xì)胞的RQ值為(569.99±85.15)，與對(duì)照組組細(xì)胞相比，MDR1表達(dá)量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的RQ值小于Tet作用組細(xì)胞的RQ值，兩組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.

9、05)。
　　 6、Western blot檢測(cè)P-gp蛋白：轉(zhuǎn)染組與Tet作用組細(xì)胞的P-gp蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組細(xì)胞。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的P-gp蛋白表達(dá)明顯低于Tet作用組細(xì)胞的P-gp蛋白表達(dá)。說(shuō)明轉(zhuǎn)染靶向MDR1的shRNA干擾質(zhì)粒和經(jīng)過(guò)Tet作用后均可在一定程度上降低LOV0/5-FU多藥耐藥細(xì)胞的P-gp蛋白表達(dá)，shRNA干擾質(zhì)粒對(duì)P-gp的抑制強(qiáng)于Tet。
　　 結(jié)論:
　　 1、shRNA干擾質(zhì)粒和