急性血栓性疾病血栓標(biāo)志物的探索性研究.pdf

1、血栓性疾?。═hrombotic diseases）是涉及臨床各科的一大類疾病。動(dòng)脈粥樣硬化及其血栓栓塞性并發(fā)癥在我國(guó)和西方國(guó)家均已成為人口死亡與致殘的第一位原因，且呈逐年上升趨勢(shì)。血栓的發(fā)生是一個(gè)較為長(zhǎng)期的過(guò)程，患者就醫(yī)時(shí)，血栓往往已經(jīng)形成并導(dǎo)致血管栓塞。心臟和腦等對(duì)缺血十分敏感的器官，發(fā)生栓塞后治療效果不佳，故血栓性疾病嚴(yán)重危害人類健康。如能在血栓發(fā)生的早期即進(jìn)行診斷并及時(shí)采取干預(yù)措施，則能夠大大降低血栓栓塞性疾病的危害。
　

2、　 目前，血栓性疾病的確診主要依靠血栓形成部位的影像學(xué)證據(jù)。臨床上主要以D-二聚體(d-dimer)、活化部分凝血酶原時(shí)間(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)bg)含量等作為血栓性疾病的初步篩查項(xiàng)目，其敏感度和準(zhǔn)確性尚無(wú)統(tǒng)一的臨床結(jié)論。血栓性疾病發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，在血栓形成早期，或血栓尚未形

3、成時(shí)，上述篩查指標(biāo)可能出現(xiàn)陰性結(jié)果，往往延誤正確判斷；而當(dāng)陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)時(shí)，疾病往往已進(jìn)展到中晚期，失去了最有效的治療時(shí)機(jī)。因此，在血栓病高危人群中，對(duì)血栓發(fā)生危險(xiǎn)性進(jìn)行全面的評(píng)估及早期診斷血栓形成已成為當(dāng)今血栓病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　 蛋白質(zhì)-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（Time of flight mass spectrometry，TOF-MS）是蛋白質(zhì)組學(xué)中一種大規(guī)模、高通量的分子研究方法，與生物信息學(xué)和基因功能實(shí)驗(yàn)等相結(jié)合已經(jīng)在揭

4、示疾病發(fā)生的分子機(jī)制領(lǐng)域中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。本試驗(yàn)采用表面增強(qiáng)激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（surface enhanced laser desorption/ionization time offlight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）及蛋白質(zhì)生物芯片技術(shù)探索性研究動(dòng)脈、靜脈血栓形成患者的血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜，旨在發(fā)現(xiàn)能夠區(qū)分血栓病與對(duì)照組的高敏感、高特異的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，為開(kāi)發(fā)新的可用于診斷血栓

5、形成的特異性標(biāo)記物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)，結(jié)合一系列與凝血、抗凝及纖溶系統(tǒng)相關(guān)的液態(tài)基因芯片檢測(cè)平臺(tái)及相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)，通過(guò)臨床研究，為發(fā)現(xiàn)血栓形成建立快速、準(zhǔn)確的早期診斷綜合體系。
　　 第一部分：急性腦梗死凝血功能變化及其危險(xiǎn)因素評(píng)估的回顧性研究
　　 目的：已有研究表明，血液中凝血、抗凝或纖溶蛋白水平的改變與腦血管疾病的發(fā)生明顯相關(guān)。但較少研究綜合考慮其在腦血管疾病中的改變及作用。在本次研究中，我們系統(tǒng)探討了其中的16

6、個(gè)凝血指標(biāo)、血脂水平、以及其他可能的危險(xiǎn)因素與急性腦梗死的關(guān)系。
　　 方法:武漢協(xié)和醫(yī)院急性腦梗死（Acute Cerebral INFarction，ACI）住院患者50例，住院對(duì)照54例。所有研究對(duì)象均在入院第二天清晨空腹采取肘靜脈血。血漿蛋白C（protein C，PC）、游離蛋白S（free protein S，F(xiàn)PS）、總蛋白S（total protein S，TPS）、凝血酶調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，

7、TM）、活化凝血因子VII（activated factor VII,FVIIa）、凝血因子VII 抗原（factor VII antigen，F(xiàn)VII Ag）、P-選擇素（p-selectin）、組織型纖溶酶原激活劑（tissue-type plasminogen activator，t-PA）及纖溶酶原激活劑抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）水平均由ELISA 試劑盒檢測(cè)；組

8、織因子活性（tissue factor activity，aTF）由發(fā)色底物法檢測(cè)；全自動(dòng)凝血分析儀（SysmexCA-7000,日本）檢測(cè)活化蛋白C（activated protein C，APC）比率、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time,PT）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）、纖維蛋白原(fibr

9、inogen,Fbg）以及D-二聚體(d-dimer）；檢驗(yàn)科自動(dòng)生化分析儀（日立7170A，東京，日本）檢測(cè)血脂水平。
　　 結(jié)論:高血壓，血漿凝血酶調(diào)節(jié)蛋白、纖維蛋白原水平及組織因子活性的升高是急性腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　 第二部分：急性深靜脈血栓形成危險(xiǎn)因素的評(píng)估
　　 目的：觀察急性下肢深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）患者凝血功能變化及評(píng)估其危險(xiǎn)因素。
　　

10、 方法：全自動(dòng)凝血分析儀（Sysmex CA-7000，日本）檢測(cè)62例急性下肢DVT 患者和70例健康對(duì)照者血漿活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time,APTT）、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)bg）及D-二聚體(d-dimer）水平；檢驗(yàn)科自動(dòng)生化分析儀（日立717

11、0A，東京，日本）檢測(cè)高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、總膽固醇（total cholesterol，TC）及甘油三酯（triglyceride，TG）水平；并通過(guò)二分類邏輯回歸分析回顧性研究所有患者的臨床資料。
　　 結(jié)論：高血壓和升高的血漿纖維蛋白

12、原是急性下肢DVT的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　 第三部分：急性血栓性疾病血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜研究
　　 實(shí)驗(yàn)一、急性腦梗死血漿潛在標(biāo)志物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 目的：既往研究表明，并不存在單一的生化指標(biāo)可用于急性腦梗死（Acute CerebralINFarction，ACI）的常規(guī)診斷。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用表面增強(qiáng)激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Surface-enhanced laser desorption/ionizatio

13、n time of flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS）技術(shù)篩選急性腦梗死患者血漿中潛在的特異標(biāo)志物。
　　 方法：入選急性腦梗死患者32例，健康對(duì)照者60例。采用SELDI-TOF-MS 及弱陽(yáng)離子交換芯片陣列技術(shù)（weak cation exchange CM10 ProteinChip arrays，CiphergenBiosystems）檢測(cè)兩組研究對(duì)象的血漿蛋白質(zhì)質(zhì)譜；并借助生物

14、信息學(xué)工具（非線性的支持向量機(jī)，nonlinear support vector machine）提出急性腦梗死的診斷模型,并運(yùn)用留一交叉驗(yàn)證法（Leave-one-out cross validation）來(lái)評(píng)估該模型的判別效能。
　　 結(jié)論：SELDI-TOF-MS 及蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在急性腦梗死的診斷中具有潛在的應(yīng)用前景。急性腦梗死的診斷可能依賴于一組生物標(biāo)志物的結(jié)合。
　　 實(shí)驗(yàn)二、急性心肌梗死及深靜脈血栓形成血漿

15、潛在標(biāo)志物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 目的：本研究運(yùn)用表面增強(qiáng)激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Surface enhanced laserdesorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）技術(shù)來(lái)尋找血栓栓塞性疾?。▌?dòng)脈和靜脈）的特異生物標(biāo)志物。
　　 方法：篩查了69例血漿樣本中的潛在生物標(biāo)志物，其中包括20例特發(fā)性深靜脈血栓形成（Deep

16、vein thrombosis，DVT）、20例急性心肌梗死（Acute myocardialiNFarction，AMI）患者以及29例既往無(wú)血栓栓塞疾病史的健康對(duì)照者。在蛋白質(zhì)生物系統(tǒng)Iic 及SELDI-TOF-MS（Ciphergen Biosystems，F(xiàn)remont，CA）上分析預(yù)先處理過(guò)的血漿樣品。并運(yùn)用銅離子活化的固定金屬鰲合親和層析芯片陣列（immobilized metalaffinity chromatograp