抵抗素與CD40在血栓性疾病中的關(guān)聯(lián).pdf

1、背景：
　　血栓性疾病包括（急性心肌梗死、動脈粥樣硬化、深靜脈血栓等）已成為威脅全人類健康的首要因素之一。其致死、致殘率均極高。經(jīng)研究證實，血管內(nèi)皮功能障礙、凝血、纖溶系統(tǒng)功能失調(diào)是引起血管內(nèi)血栓形成的重要病理過程。抵抗素（Resistin）為新近發(fā)現(xiàn)的一種脂肪細胞因子，因其具有胰島素抵抗作用而得名?，F(xiàn)有研究結(jié)果證實，抵抗素的作用不僅與胰島素抵抗、2型糖尿病、肥胖等密切相關(guān)，而且在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中也起到重要作用。經(jīng)研究證實，

2、血漿高抵抗素水平是急性心肌梗死等血栓相關(guān)疾病的危險因素。此外，抵抗素也可促進血管內(nèi)皮細胞素-1（endothelin-1, ET-1）、血管性血友病因數(shù)（von Willebrand factor, vWF）、血管細胞間粘附分子（vascular cell adhension molecule, VCAM）等的分泌表達，造成血管內(nèi)皮功能障礙，從而參與血栓性疾病的發(fā)生與發(fā)展。
　　本課題組前期研究結(jié)果證明，在體外組織型纖溶酶原激活物

3、-1（plasminogen activator inhibitor-1）的表達在基因及蛋白水平上均產(chǎn)生一定影響，并進一步證實了抵抗素干預后血管內(nèi)皮細胞絲裂元活化激酶（mitogen avtivated protein kinase, MAPK）通路的啟動與PAI-1的表達有一定的關(guān)系，初步揭示了抵抗素的細胞內(nèi)作用因素，為血栓性疾病的防治提供了新的思路及理論依據(jù)。但目前尚未發(fā)現(xiàn)抵抗素的胞膜作用位點。
　　CD40是Ⅰ型跨膜蛋白受體

4、，是腫瘤壞死因數(shù)超家族的一員，B細胞是表達 CD40的主要細胞，但其他細胞，如上皮細胞，成纖維細胞，血管內(nèi)皮細胞，血管平滑肌細胞等也表達 CD40。CD40L為 CD40的配體，通過與CD40的結(jié)合啟動下游信號轉(zhuǎn)導通路，進而引發(fā)一系列生物效應(yīng)。
　　近年來已被證實 CD40/CD40L系統(tǒng)的啟動在心肌梗死等血栓性疾病起到重要的作用。因此 CD40/CD40L系統(tǒng)也成為心血管研究領(lǐng)域中的熱點。目前已知在參與動脈粥樣斑塊形成的多種細胞

5、中CD40/ CD40L高表達，但其具體作用還未闡明?，F(xiàn)已知在動脈粥樣硬化形成的起始階段，CD40/ CD40L能使內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞活化并且能增強其他粘附因子的表達。且最近研究結(jié)果表明 CD40/ CD40L能增強在血管比重的樹突狀細胞與T淋巴細胞的相互作用。CD40L能促進頸動脈及冠狀動脈粥樣硬化斑塊中樹突狀細胞的成熟和T淋巴細胞的滲入，這都是使粥樣斑塊不穩(wěn)定的特征。
　　且查閱文獻得知，在 CD40/CD40L系統(tǒng)啟動后，

6、也是通過啟動 MAPK信號轉(zhuǎn)導通路進行下游信號轉(zhuǎn)導，且現(xiàn)有文獻報導，在抵抗素的作用下內(nèi)皮細胞CD40的表達升高。
　　由此本課題組成員大膽假設(shè)，抵抗素可能是通過與胞膜上的CD40相互作用，啟動下游信號轉(zhuǎn)導通路，繼而在血栓性疾病的發(fā)生及發(fā)展過程中起到一定作用。
　　目的：
　　因此本實驗通過體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs），觀察單獨抵

7、抗素作用下，及在 CD40抗體將 CD40封閉前提下再加入抵抗素作用，對t-PA, PAI-1表達的影響，并進一步測定MAPK通路活化情況進而推測CD40是否為抵抗素位于細胞膜上的作用位點或作用位點之一。
　　*本實驗所采用抵抗素濃度為本課題組前期篩選出的最佳作用濃度
　　方法：
　　1. HUVECs3-4代分為單純培養(yǎng)基對照組、抵抗素組（50ng/ml）、CD40抗體組、CD40抗體（2ug/mg,提前孵育0.5h

8、）+抵抗素組培養(yǎng)48小時后，ELISA法測各組上清中t-PA和PAI-1蛋白含量；
　　2. HUVECs3-4代分為單純培養(yǎng)基對照組、抵抗素組（50ng/ml）、CD40抗體組、CD40抗體（2ug/mg,提前孵育0.5h）+抵抗素組培養(yǎng)48小時后，提取 RNA以 real time RT-PCR法測定各組t-PA和PAI-1的RNA含量。
　　*CD40作用時間及濃度為查閱文獻所得
　　結(jié)果：
　　1.抵抗素

9、單獨作用組與CD40抗體+抵抗素作用組相比，在抵抗素作用48h后，t-PA蛋白表達在 CD40+抗體組較抵抗素組相比無顯著變化，PAI-1蛋白表達在 CD40+抗體組較抵抗素組相比下調(diào)（P<0.05）。
　　2.抵抗素單獨作用組與CD40抗體+抵抗素作用組相比，在抵抗素作用48h后，t-PA基因表達在 CD40+抗體組較抵抗素組相無顯著影響，PAI-1基因表達在 CD40+抗體組較抵抗素組相比下調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論