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文檔簡介
1、目的:
1.觀察EtNBSe-PDT對體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞增殖活性及TGF-β1分泌的影響。
2.觀察EtNBSe-PDT對體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞內(nèi)MAPK家族成員ERK、JNK、P38活性影響和信號蛋白的時相性變化,以及抑制劑干預(yù)中磷酸化表達(dá)水平的影響。
方法:
1.分離培養(yǎng)正常人包皮成纖維細(xì)胞,采用角蛋白和Ⅰ、Ⅲ型膠原染色進(jìn)行成纖維細(xì)胞的鑒定。
2.采用梯度紅光照射、
2、梯度EtNBSe濃度和EtNBSe聯(lián)合紅光照射處理成纖維細(xì)胞;在抑制劑干預(yù)研究中,應(yīng)用ERK、JNK、P38信號通路特異性抑制劑(PD98059、SP600125、SB203580)分別處理成纖維細(xì)胞,四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測各組成纖維細(xì)胞增殖和抑制的變化。
3.EtNBSe聯(lián)合紅光照射處理成纖維細(xì)胞,酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測TGF-β1分泌變化。
4.蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot)
3、法測定磷酸化ERK、JNK、P38的活性及時相性變化;同時觀察在抑制劑干預(yù)中,磷酸化ERK、JNK、P38的變化。
結(jié)果:
1.體外培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)Ⅰ、Ⅲ型膠原染色陽性,角蛋白染色陰性,細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞形態(tài)。
2.成纖維細(xì)胞經(jīng)梯度紅光照射(10、30、60、90min)后,與對照組比較,細(xì)胞不產(chǎn)生明顯的細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒效應(yīng)(P>0.05)。在梯度濃度EtNBSe(30、60、120、240pM)分
4、別作用培養(yǎng)1、2h后,各組細(xì)胞間未觀察到明顯的增殖活性和細(xì)胞毒反應(yīng)(P>0.05)。在梯度EtNBSe(30、60、120、240pM)+紅光照射組,梯度EtNBSe處理1h后照光,與對照組比較,對細(xì)胞不產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒反應(yīng)及細(xì)胞增殖活性(P>0.05);在梯度EtNBSe處理2h后照光,EtNBSe(30、60、120pM)對成纖維細(xì)胞有增殖活性,以EtNBSe(60、120pM)增殖活性最明顯(P<0.05)。在抑制劑干預(yù)組中,與對
5、照組比較,抑制劑中(PD98059、SB203580)+照光組,細(xì)胞活性受到明顯抑制(P<0.05);SP600125細(xì)胞活性無明顯變化。
3.與對照組比較,成纖維細(xì)胞在經(jīng)60、120pM EtNBSe-PDT處理后,TGF-β1分泌均增加(P<0.05),以120pM更明顯。
4.濃度組:與對照組比較,30、60、120pMEtNBSe-PDT可促進(jìn)磷酸化ERK蛋白的活化;30、60pM可促進(jìn)磷酸化JNK和
6、P38蛋白的活化,隨著劑量的增加逐漸抑制兩者的活性。時間組:ERK、JNK、P38均有不同程度的活化,與對照組比較,ERK在60分鐘時達(dá)到峰值;JNK和P38在90分鐘時達(dá)到峰值。干預(yù)組:與對照組比較,PD98059、SB203580可顯著抑制磷酸化ERK、P38的活性;SP600125對磷酸化JNK抑制作用不明顯。
結(jié)論:
1.EtNBSe-PDT可促進(jìn)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)TGF-β1分泌的增加
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