穩(wěn)定表達(dá)Tet on 3G的Sf9細(xì)胞系及其轉(zhuǎn)基因粘蟲品系構(gòu)建的探索.pdf

1、鱗翅目為昆蟲綱中第二大目，僅次子鞘翅目，大部分為植食性昆蟲且多數(shù)為農(nóng)業(yè)害蟲。目前化學(xué)防治仍然是這類害蟲的主要防治方法，造成了嚴(yán)重的環(huán)境問題。對此類害蟲的分子機(jī)理研究不夠深入導(dǎo)致難以開發(fā)出其他對環(huán)境更友好的防治方法。在之前的研究中，本實(shí)驗(yàn)室基于桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒AcMNPV和Tet-On系統(tǒng)構(gòu)建了可以用作研究鱗翅目昆蟲分子機(jī)理的復(fù)制可控型AcMNPV載體，但存在背景表達(dá)過高的問題。
　　為了降低四環(huán)素調(diào)控的Tet-O

2、n系統(tǒng)中的背景表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)換用了背景表達(dá)更低，誘導(dǎo)表達(dá)量更高且對強(qiáng)力霉素(Dox)誘導(dǎo)更敏感的Tet-On3G系統(tǒng)。利用Bac-to-Bac系統(tǒng)改造AcMNPV基因組，使其復(fù)制必需基因dnapol或lef3的表達(dá)受PTRE3g誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制，同時(shí)插入增強(qiáng)型綠色熒光基因(EGFP)作為報(bào)告基因。將重組的AcMNPV基因組轉(zhuǎn)染已構(gòu)建的可穩(wěn)定表達(dá)Tet on3G的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，從而在細(xì)胞水平檢測其作為復(fù)制可控型載體的可行性。
　　為了

3、避免背景表達(dá)的疊加，實(shí)驗(yàn)將系統(tǒng)中的必須部分——反式轉(zhuǎn)錄活化因子Teton3g的表達(dá)通過轉(zhuǎn)基因的方法轉(zhuǎn)移到了作為宿主的Sf9細(xì)胞中或粘蟲體內(nèi)，進(jìn)一步避免了可能出現(xiàn)的背景表達(dá)加深現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了多個(gè)不同的PiggyBac穿梭載體及兩個(gè)轉(zhuǎn)基因Sf9細(xì)胞系:Sf9(PIE1-Tet on3G)和Sf9(opie2-Tet on3g)。在RNA水平、蛋白水平及細(xì)胞水平檢測了反式轉(zhuǎn)錄活化因子Tet on3g在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中的表達(dá)，并且在細(xì)胞水平驗(yàn)證