轉(zhuǎn)化生長因子-β受體Ⅱ在慢性胰腺炎胰腺組織中的表達(dá)及氧化苦參堿的影響.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)以Wistar大鼠慢性胰腺炎(CP)模型為研究對象，以氧化苦參堿(OM)進(jìn)行治療干預(yù)，觀察Wistar大鼠CP模型的制備效果，對胰腺組織進(jìn)行病理觀察；通過檢測血清淀粉酶(AMY)、透明質(zhì)酸酶(HA)、層粘連蛋白(LN)及Ⅲ型前膠原蛋白肽(PCⅢ)的變化，研究OM對大鼠CP的影響及量效關(guān)系；通過蛋白免疫印跡法(Western blot)等技術(shù)檢測大鼠胰腺組織轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅱ(TβRⅡ)的動態(tài)變化，評價TβRⅡ在CP中表達(dá)的

2、意義，觀察OM對CP的治療作用和對TβRⅡ表達(dá)量的影響。同時結(jié)合前期研究及相關(guān)研究結(jié)果，探討TβRⅡ在CP中可能的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及OM對此過程可能的影響及機(jī)制，為治療CP胰腺纖維化探索新途徑，同時為OM的進(jìn)一步研究、開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：第一部分：雄性Wistar大鼠80只用隨機(jī)數(shù)字表法分為陰性對照組(NC，n=16)和CP模型組(CP，n=64)，CP模型組根據(jù)注射劑量的不同再分為4個小組(n=16)。CP模型組

3、隔日給予腹腔注射一次二乙基硫代氨基甲酸鹽(DDC)，NC組同時給予生理鹽水腹腔注射。各組實(shí)驗(yàn)動物按注射DDC的時間取4個不同時相點(diǎn)(6d，12d，24d，32d)，再分為4個小組，每組4只。各組分別在預(yù)定的時間點(diǎn)采集頸動脈血液和胰腺等組織，大體觀察大鼠，并采用全自動生化分析儀檢測AMY，取胰腺組織HE和Masson染色制片，觀察胰腺組織的病理學(xué)變化，對DDC造模做出評價。第二部分：在第一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上得出最佳的造模劑量(700mg/

4、kg)，進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。雄性Wistar大鼠28只，隨機(jī)分為7組(n=4)，包括CP組，NC組和OM Ⅰ-Ⅴ組。CP組和OM每組注射等量的DDC，方法同第一部分實(shí)驗(yàn)。OM Ⅰ-Ⅴ組5組在制模時各組分別給予不同的OM注射量，OM自注射DDC的第一天起同時注射，每天一次。在注射30天后，采取動脈血和胰腺等組織，ELISA法檢測HA、LN和PCⅢ，Western blot測定胰腺組織α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)蛋白含量檢測并進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)步

5、驟同上。 第三部分：在前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上得出最佳的造模劑量(DDC，700mg/kg)與最佳的治療劑量(OM，100mg/kg)進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)，雄性Wistar大鼠40只，隨機(jī)分為4組(n=10)正常對照組(NC)、CP模型組(CP)、OM干預(yù)組(OP)及OM治療組(OT)。每組分為兩個時間點(diǎn)(20d、40d)，每組5只。按實(shí)驗(yàn)計劃，在規(guī)定時間點(diǎn)采取動脈血和胰腺等組織，提取胰腺組織蛋白，Western blot測定胰腺組織TβR

6、Ⅱ蛋白含量。所有實(shí)驗(yàn)圖片用Image-Pro Plus Version 5.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。計數(shù)資料用X2檢驗(yàn)，計量資料用t檢驗(yàn)和方差分析。 結(jié)果：第一部分(1)AMY結(jié)果顯示，CP各組在6d時間點(diǎn)與NC組相比顯著升高(P<0.05)，在12d時間點(diǎn)僅有CPⅠ和CPⅢ與NC組相比顯著升高(P<0.05)。(2)觀察并發(fā)癥和死亡率，CP各組與CPⅠ相比較，CPⅡ、Ⅲ和Ⅳ組的尿失禁并發(fā)癥較CPⅠ有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05

7、)，CPⅣ出血較明顯(P<0.05)，各組在震顫方面無明顯差別。CPⅢ和CPⅣ出現(xiàn)死亡，其死亡率兩組無差別。(3)胰腺組織的膠原組織的面積百分比，在6d組中，除CPⅠ外各組與NC組均有明顯增多(P<0.05)，尤以CPⅢ為著(P<0.01)，在12d，24d的增多更為明顯，在32天中，因?yàn)镃PⅣ全部死亡，無法比較，余者皆有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。第二部分：(1)血清學(xué)指標(biāo)：HA、LN和PCⅢ的NC組均較其他各組為低(P<0.05)，

8、而CP組與OMⅠ組無顯著性差異(P>0.05)。(2)膠原纖維面積百分比我們也可以看出，OM可以抑制纖維化的發(fā)展，OM各組除Ⅰ組外均較CP組有顯著性差異(P<0.05)。(3)α-SMA的Western blot結(jié)果顯示，α-SMA在CP時表達(dá)量上調(diào)，OM可以降低α-SMA的表達(dá)，OM在劑量50-400mg/kg之間α-SMA的表達(dá)無劑量依賴性，以100mg/kg為最佳劑量。 第三部分：(1)OP組在20d和40d均較同時期的C

9、P組膠原面積百分比減少有顯著性差異(P<0.05)，三組在40d均比同組的20d的的膠原面積增加有顯著性差異(P<0.05)，但是OT組與CP組比較，在兩個時間點(diǎn)均無顯著性差異(P>0.05)。(2)TβRⅡ的Western blot結(jié)果顯示，NC組在各時間點(diǎn)變化不明顯，無顯著性差異(P>0.05)；OP組和OT。組與CP組各時間點(diǎn)的比較有顯著性差異(P<0.05)，OP組與OT組比較各個時間點(diǎn)有顯著性差異(P<0.05)，40d時間點(diǎn)