氧化苦參堿對慢性胰腺炎細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的：慢性胰腺炎（CP）是以胰腺實(shí)質(zhì)內(nèi)腺泡和小管受到反復(fù)或持續(xù)性損害，引起腺泡和胰島細(xì)胞萎縮或消失的病理學(xué)過程，而細(xì)胞凋亡與胰腺炎存在一定的相關(guān)性，凋亡程度與胰腺炎的病情嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。研究表明，腫瘤壞死因子-α（TNFα）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGFβ）、Fas是參與細(xì)胞凋亡的重要因子。Fas和TNF分別與其相應(yīng)受體FasL和TNFR-1結(jié)合，再結(jié)合胞內(nèi)相應(yīng)的死亡域并下傳凋亡信號，激活下游的級聯(lián)反應(yīng)而觸發(fā)凋亡。氧化苦參堿（OM）是一種

2、從中藥苦參中分離得到的生物堿，有研究表明OM具有明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)以Wistar大鼠為研究對象，觀察Wistar大鼠CP模型的制備效果，并以O(shè)M進(jìn)行治療干預(yù)。對胰腺組織進(jìn)行病理觀察；應(yīng)用透射電鏡對胰腺腺泡細(xì)胞、胰島細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察；應(yīng)用TVNEL技術(shù)對胰腺腺泡細(xì)胞、胰島細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，計(jì)算凋亡指數(shù)：應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測胰腺組織Fas含量變化；應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測胰腺組織TNFα

3、、TGFβ含量變化。結(jié)合前期研究及相關(guān)研究結(jié)果，探討Fas、TNFα、TGFβ在CP中可能的作用機(jī)制及OM對此過程的影響及其可能機(jī)制，為CP治療探索新途徑，同時(shí)為OM的進(jìn)一步研究、開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：第一部分：雄性Wistar大鼠80只（220-250g）用隨機(jī)數(shù)字表法分為陰性對照組（NC，n=16）和CP模型組（CP，n=64），CP模型組根據(jù)注射劑量的不同再分為4個小組（n=16）。CP模型組隔日給予腹腔注

4、射一次二乙基硫代氨基甲酸鹽（DDC），NC組給予生理鹽水腹腔注射。各組實(shí)驗(yàn)動物按注射DDC的時(shí)間取4個不同時(shí)相點(diǎn)（6d，12d，24d，32d），再分為4個小組，每組4只。各組分別在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)采集頸動脈血液和胰腺等組織，大體觀察大鼠，并采用全自動生化分析儀檢測AMY，取胰腺組織HE和Masson染色制片，觀察胰腺組織的病理學(xué)變化，對DDC造模做出評價(jià)。
　　 第二部分：在第一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上得出最佳的造模劑量，進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。

5、雄性Wistar大鼠28只，隨機(jī)分為7組（n=4），包括CP組，NC組和OMⅠ-Ⅴ組。CP組和OM每組注射等量的DDC，方法同第一部分實(shí)驗(yàn)。OMⅠ-Ⅴ組5組在制模時(shí)各組分別給予不同的OM注射量，OM自注射DDC的第一天起同時(shí)注射，每天一次。在注射30天后，采取動脈血和胰腺等組織，ELISA法檢測HA、LN和PCⅢ，Western blot測定胰腺組織α-SMA蛋白含量檢測并進(jìn)行分析，得出OM治療CP的最佳量效關(guān)系。
　　 第三部

6、分：在第一部分和第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。雄性Wistar大鼠32只（220-250g），隨機(jī)分為4組（n=8），包括CP組，OM組，HM組和NC組。CP、OM和HM每組注射等量的DDC，方法同第一部分實(shí)驗(yàn)。CP模型制備后給予OM組腹腔注射進(jìn)行治療（劑量為第二部分的最佳劑量）；給予HM組地塞米松腹腔注射進(jìn)行治療，劑量100mg/kg。30d后手術(shù)取出胰腺組織，應(yīng)用透射電鏡對胰腺腺泡細(xì)胞、胰島細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察。應(yīng)用TUNEL

7、技術(shù)對胰腺腺泡細(xì)胞、胰島細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，計(jì)算凋亡指數(shù)。應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測胰腺組織Fas含量變化。應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測胰腺組織TNFα、TGFβ含量變化。
　　 所有實(shí)驗(yàn)圖片用Image-Pro Plus Version5.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。應(yīng)用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用x2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)和方差分析。
　　 結(jié)果：第一部分（1）AMY結(jié)果顯示，CP各組在6d時(shí)間點(diǎn)

8、與NC組相比顯著升高（P<0.05），在12d時(shí)間點(diǎn)僅有CPⅠ和CPⅢ與NC組相比顯著升高（P<0.05）。（2）觀察并發(fā)癥和死亡率，CP各組與CPⅠ相比較， CPⅡ、Ⅲ和Ⅳ組的尿失禁并發(fā)癥較CPⅠ有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CPⅣ出血較明顯（P<0.05），各組在震顫方面無明顯差別。CPⅢ和CPⅣ出現(xiàn)死亡，其死亡率兩組無差別。（3）胰腺組織的膠原組織的面積百分比，在6d組中，除CPⅠ外各組與NC組均有明顯增多（P<0.05），尤以C

9、PⅢ為著（P<0.01），在12d，24d的增多更為明顯，在32天中，因?yàn)镃PⅣ全部死亡，無法比較，余者皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　 第二部分：（1）血清學(xué)指標(biāo)：HA、LN和PCⅢ的NC組均較其他各組為低（P<0.05），而CP組與OMⅠ組無顯著性差異（P>0.05）。（2）膠原纖維面積百分比我們也可以看出，OM可以抑制纖維化的發(fā)展，OM各組除Ⅰ組外均較CP組有顯著性差異（P<0.05）。（3）α-SMA的Wester

10、n blot結(jié)果顯示，α-SMA在CP時(shí)表達(dá)量上調(diào)，OM可以降低α-SMA的表達(dá)，OM在劑量50-400mg/kg之間α-SMA的表達(dá)無劑量依賴性，以100mg/kg為最佳劑量。
　　 第三部分：（1）血清淀粉酶測定結(jié)果：CP，OM，HM各組較NC組相比顯著升高（P<0.05）；CP組大鼠血清淀粉酶的含量顯著高于OM組與HM組（P<0.05）。（2）TUNEL技術(shù)檢測結(jié)果：OM組和HM組凋亡率顯著高于CP組（P<0.05）。（3

11、）Western blot技術(shù)檢測胰腺組織Fas含量變化結(jié)果顯示OM組與HM組Fas蛋白含量顯著高于NC組（P<0.05）。（4）ELISA技術(shù)檢測胰腺組織TNFα、TGFβ：OM組和HM組大鼠血漿 TNFα含量顯著高于NC組（P<0.05），而OM組和HM組大鼠血漿TGFβ含量顯著高于NC組（P<0.05），結(jié)果提示，TGFβ含量的升高可能與胰腺細(xì)胞的增殖有關(guān)，促進(jìn)組織修復(fù)。
　　 結(jié)論：（1）隔日一次腹腔注射700mg/kg