PDGF及其受體在慢性胰腺炎胰腺纖維化機制中的作用及其對策的研究.pdf

1、第一部分 目的：建立慢性胰腺炎大鼠模型。 方法：wister大鼠84只，隨機分為模型組、對照組。各組大鼠均暴露膽胰管，以微動脈夾夾閉其近肝門處，以41/2針頭穿刺膽胰管。模型組用微量輸液泵40分鐘內(nèi)輸注含2％三硝基苯磺酸(TNBS)的10％乙醇PBS溶液0.4m1。對照組輸注等量等濃度的乙醇PBS溶液。兩組分別于術后第1、2、3、4、5、6、7周各時間點取胰腺組織，每次每組各6只大鼠。胰腺組織標本切片，行HE染色、Mas

2、son膠原染色，光鏡觀察。應用電鏡觀察胰腺組織超微結(jié)構(gòu)的變化。參照試劑盒說明測定血清淀粉酶、C肽、透明質(zhì)酸含量。應用免疫組織化學方法檢測I型膠原在胰腺組織中的表達。 結(jié)果： 1．光鏡下：對照組胰腺組織未見明顯纖維化。模型組第1、2周胰腺組織可見炎癥細胞浸潤，未見有明顯纖維化。第3周可見胰管擴張，胰腺小葉周圍及間質(zhì)內(nèi)纖維組織輕度增生。Masson膠原染色可見胰腺間質(zhì)及部分小葉內(nèi)有藍色膠原纖維沉積。第4周時，胰管增生明顯，胰

3、管周及胰腺小葉間、小葉內(nèi)纖維組織增生明顯，并有炎癥細胞浸潤，局部可見胰腺腺體萎縮，腺體萎縮部位有纖維組織代替，胰腺內(nèi)分泌組織未見有明顯纖維化。Masson膠原染色可見胰腺間質(zhì)及小葉內(nèi)可見大量的藍色膠原纖維。術后第5、6、7周胰腺組織病理改變與第4周相似，無明顯改變。2．電鏡下：對照組可見胰腺腺胞、胰管上皮細胞線粒體腫脹，間質(zhì)內(nèi)纖維無明顯增多。模型組第1、2周胰腺間質(zhì)內(nèi)可見少量活化的胰腺星狀細胞(PSC)，其內(nèi)維生素A脂滴消失，胰腺腺胞

4、線粒體腫脹、有多種囊泡形成。第3周，胰腺組織間質(zhì)內(nèi)活化的PSC以及成纖維細胞明顯增多，間質(zhì)內(nèi)纖維增多，腺胞內(nèi)線粒體明顯腫脹、透明。第4周時，胰腺組織間質(zhì)內(nèi)活化的PSC、成纖維細胞、巨噬細胞明顯增多，間質(zhì)內(nèi)可見大量的纖維成分。胰腺腺胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴張，腺胞體積減少。第5、6、7周胰腺組織變化基本同第4周。 3．胰腺組織Ⅰ型膠原的表達：對照組在胰腺間質(zhì)有少量表達，模型組第2周可見胰腺間質(zhì)內(nèi)有少量著色，第3周胰腺間質(zhì)內(nèi)有明顯表達，

5、第4～7周胰腺間質(zhì)內(nèi)表達明顯增加。 4．胰腺組織膠原染色圖像分析：模型組胰腺組織內(nèi)膠原面積百分比：各時間點分別為6.50±3.64％、8.55±4.19％、19.23±5.20％，37.29±6.74％，35.85±6.15％，34.50±6.44％，33.49±5.68％。第1、2周與對照組無明顯差異，第3、4、5、6、7周分別明顯強于對照組，第3周與其后各時間點比較差異明顯(均/P<0.01)，第4、5、6、7周比較差

6、異無顯著性(均P>0.05)。 5．血清淀粉酶在模型組的測定值均較對照組升高(均P<0.01)。血清透明質(zhì)酸、C肽在第3～7周均明顯高于對照組(均P<0.01)。 結(jié)論： 1．膽胰管內(nèi)注射2％TNBS乙醇PBS溶液的方法成功復制慢性胰腺炎的動物模型。 2．本方法可反映急性胰腺炎向慢性胰腺炎轉(zhuǎn)化的動態(tài)過程，符合人類慢性胰腺炎病情演變的規(guī)律。 3．本方法造模4周，既可滿足研究需要。第二部分 P

7、DGF及其受體在慢性胰腺炎胰腺纖維化機制中的作用 目的：探討血小板源生長因子(PDGF)及其受體(PDGFR)在胰腺纖維化過程中的作用及意義。 方法：wister大鼠隨機分為對照組、模型組。采用膽胰管內(nèi)注射含2％TNBS的10％乙醇PBS溶液0.4ml的方法制備慢性胰腺炎大鼠動物模型。應用免疫組織化學方法檢測PDGF-A、PDGF-B、PDGFR-α、PDGFR-β及α一平滑肌肌動蛋白(α-SMA)在術后第1、2、3、4

8、、5、6、7周胰腺組織中的表達；應用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應技術(RT-PCR)檢測模型組不同時期PDGFmRNA、PDGFR mRNA的表達。 結(jié)果： 1．免疫組化染色：對照組PDGF、PDGFR在腺泡細胞、胰腺間質(zhì)內(nèi)低表達，PDGFR-α僅在術后第1周表達；α-SMA少量表達于血管壁。模型組中，PDGF-A、PDGF-B主要在胰腺間質(zhì)、纖維化區(qū)、炎癥細胞浸潤區(qū)表達；PDGF-A在造模后第1周表達明顯上調(diào)，在第2～7周表達

9、逐漸下調(diào)；PDGF-B在造模后第1～4周表達逐漸上調(diào)，在第5～7周表達下調(diào)；PDGFR-α在造模后第1、2周主要在胰腺間質(zhì)、纖維間隔中表達，其余時間點胰腺組織中未見表達；PDGFR-β主要在胰腺間質(zhì)、纖維間隔、纖維化區(qū)表達，在造模后第l～4周表達逐漸上調(diào)，在第5～7周表達下調(diào)。PDGF-B、PDGFR-β的表達分別明顯強于同時期PDGF-A、PDGFR-α(均P<0.01)；第4周α-SMA主要表達在胰腺間質(zhì)、纖維化區(qū)等部位；PDGF-

10、B、PDGFR-β、α-SMA在模型組中表達較對照組明顯增強(均P<0.01)；PDGF-A在第1、2周的表達強于對照組(均P<0.05)：PDGFR-α在第1、2周的表達強于對照組(均P

11、R-α的表達無相關(均P>0.05)。2．PDGF mRNA、PDGFR mRNA在模型組中的表達：PDGF-A mRNA、PDGFR-α mRNA表達呈逐漸下調(diào)趨勢；PDGF-B mRNA表達呈先逐漸上調(diào)，于第3、4周達高峰，第5-7周表達逐漸下調(diào)；PDGFR-β mRNA表達呈先逐漸上調(diào)，于第4周達高峰，第5-7周表達逐漸下調(diào)。 結(jié)論： 1．PDGF、PDGFR可促進慢性胰腺炎發(fā)生纖維化過程。其中PDGF-B及

12、PDGFR-β作用尤為突出。 2．PDGF、PDGFR促慢性胰腺炎胰腺纖維化的作用主要發(fā)生在病程的早、中期。 第三部分 己酮可可堿對大鼠慢性胰腺炎胰腺纖維化干預的研究 目的：觀察己酮可可堿(PTX)對大鼠慢性胰腺炎胰腺纖維化的影響。 方法：Wister大鼠18只，隨機分為正常對照組、模型組、PTX干預組。采用膽胰管內(nèi)注射含2％TNBS的10％乙醇PBS溶液0.4m1的方法制備慢性胰腺炎大鼠動物模型。術后第

13、2天PTX干預組大鼠開始腹腔注射PTX，劑量為6mg/Kg.d，模型組腹腔注射等量生理鹽水。三組大鼠均于術后第4周處死取胰腺。采用免疫組化技術檢測α-SMA、PDGF、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1、2(P-ERK<,1>、P-ERK<,2>)、Ⅰ型膠原(COLⅠ)在胰腺組織中表達同時做組織膠原染色。部分胰腺組織液氮凍存，應用免疫印跡(Western blot)方法檢測α-SMA、P-ERK<,1>、P-ERK<,2>在胰腺組織中的表達。

14、 結(jié)果：術后第4周，模型組發(fā)生胰腺纖維化，PTX干預組有輕度纖維化。免疫組化染色顯示：PTX干預組α-SMA、PDGF、P-ERK<,1>、P-ERK<,2>、COLⅠ的表達均低于模型組(均P<0.05)。膠原染色顯示：PTX干預組膠原面積百分比明顯低于模型組(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示α-SMA、P-ERK<,1>、P-ERK<,2>在PTX干預組中的蛋白表達明顯低于模型組。 結(jié)論： 1