卵巢癌腹膜亞臨床轉(zhuǎn)移阻斷治療新策略的初步探討.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文卵巢癌腹膜亞臨床轉(zhuǎn)移阻斷治療新策略的初步探討姓名：董武申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：徐惠綿20040401子，旨在為防治卵巢癌腹膜種植性轉(zhuǎn)移提供新的阻斷治療策略。材料與方法1細(xì)胞培養(yǎng)：①人卵巢癌細(xì)胞株CAOV3及小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3的培養(yǎng)：在含10％胎牛血清，100U／ml青霉素，100pg／ml鏈霉素的RPMll640培養(yǎng)基中貼壁生長，于37℃、5％CO：、95％空氣培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。@)NIH

2、3T3細(xì)胞條件介質(zhì)制備：細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至80％融合，用含001％小牛血清白蛋白(BSA)培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，取培養(yǎng)液10009離心10rain，取上清，一20℃保存。2RGDapPEG雜交肽、cD私和整合素B，基因反義寡核苷酸的構(gòu)建：RGD三肽由深圳市翰宇生物工程有限公司合成、提純。并采用異丙基碳化二亞胺(DIC)方法使apPEG與天冬氨酸羥基結(jié)合，在此基礎(chǔ)上分步合成甘氨酸一天冬氨酸多肽。RGDapPEG雜交肽交聯(lián)過程的中間產(chǎn)物用分子篩色譜

3、法純化，終末產(chǎn)物經(jīng)高壓液相色譜法(HPLC)純化，氨基酸序列分析確認(rèn)。應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)確定CD私、整合素B?；蛐蛄?，設(shè)計(jì)反義核酸及隨機(jī)序列對照片段，合成寡核苷酸片段、并用生物素標(biāo)記。3MTY法測定細(xì)胞殺傷率：收集對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于96孔板，加入相應(yīng)的處理因素，陰性對照組每孔加入100txl培養(yǎng)液，陽性對照組加入等量的培養(yǎng)液及DMSO。培養(yǎng)24、48、72h，各孔加入50斗IMIT(1mg／rrd)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清，加入15

4、0xlDMSO震蕩溶解10min，酶標(biāo)儀492nm波長下測吸光度(A)值。殺傷率公式為(A用藥一A陰性對膩)／(A陽性對照一A陰性對照)。4癌細(xì)胞粘附力測定：①取96孔培養(yǎng)板，覆以Matrigel8trg／孔，4。C過夜；②37℃孵育1h，無血清培養(yǎng)液洗兩次；③加預(yù)處理的癌細(xì)胞懸液，l104／孔，3712搖床100rpm緩慢振蕩30min；@PBS洗兩次；⑤棄上清，無血清培養(yǎng)液洗一次；⑥加無血清培養(yǎng)液150m及MTT(1mg／rrd)5