透明質(zhì)酸及其受體對單核細胞粘附和遷移的作用.pdf

1、目的:研究單核細胞和肺微血管內(nèi)皮細胞的HA分布、HA受體CD44和ICAM-1的表達以及HA及其受體對單核細胞粘附和遷移的作用.材料和方法用Percoll非連續(xù)密度梯度兩次離心法分離狗靜脈血單核細胞,用兩次植塊法分離狗PMVECs.通過親和熒光染色標記單核細胞以及PMVECs的HA,用免疫熒光染色法標記單核細胞和PMVECs的CD44以及單核細胞的ICAM-1.經(jīng)HAase消化單核細胞表面的HA后,觀察單核細胞的粘附.通過在培養(yǎng)皿底面涂

2、布HA和在培養(yǎng)液中添加HA,比較單核細胞的粘附.用抗體阻斷單核細胞的CD44和ICAM-1后,比較粘附的單核細胞數(shù)目.在單核細胞與PMVECs共培養(yǎng)實驗,消化單核細胞表面的HA和阻斷單核細胞的CD44后,觀察單核細胞在內(nèi)皮單層上的粘附,并在掃描電鏡下觀察單核細胞粘附于內(nèi)皮單層后的形態(tài)學特征.通過用HAase消化掉單核細胞表面的HA、在細胞培養(yǎng)池膜上涂布HA和在培養(yǎng)液中添加HA,計數(shù)跨膜遷移的單核細胞.阻斷單核細胞的CD44和ICAM-1

3、后,觀察單核細胞跨膜遷移的變化.結(jié)果:經(jīng)Percoll非連續(xù)密度梯度兩次離心法分離的單核細胞以及經(jīng)兩次植塊法分離的PMVECs,純度為95﹪以上.該實驗分離的單核細胞和PMVECs具有較高的活性.單核細胞表面和細胞內(nèi)存在HA,表達CD44和ICAM-1.PMVECs表面有HA,表達CD44.用HAase消化掉單核細胞表面HA后,粘附于培養(yǎng)皿底的單核細胞減少,粘附于內(nèi)皮單層上的單核細胞無明顯變化.在培養(yǎng)皿底面涂布HA后,粘附的單核細胞增多

4、.在培養(yǎng)液中加入HA后,粘附的細胞減少.阻斷單核細胞的CD44后粘附于HA底物和內(nèi)皮單層上的單核細胞減少.阻斷ICAM-1后粘附于HA底物的細胞數(shù)無明顯變化.消化單核細胞表面的HA后,跨膜遷移的單核細胞減少.在細胞培養(yǎng)池的膜上面涂布HA后,跨膜遷移的單核細胞增多.培養(yǎng)液中添加HA后,跨膜遷移的單核細胞減少.阻斷單核細胞的CD44后,跨膜遷移的細胞減少.阻斷ICAM-1后跨膜遷移的細胞數(shù)無明顯變化.結(jié)論:單核細胞Percoll非連續(xù)密度梯

5、度兩次離心法和PMVECs兩次植塊法具有方法簡便、分離細胞的純度和活性高等優(yōu)點.單核細胞表面和細胞內(nèi)分布有HA,在細胞表面表達CD44和ICAM-1.PMVECs表面存在HA,表達CD44.單核細胞表面HA和底物HA促進單核細胞的粘附,但游離HA阻礙單核細胞的粘附.CD44對于單核細胞粘附于HA底物和肺微血管內(nèi)皮具有介導作用.單核細胞表面HA和底物HA促進單核細胞的遷移,但游離HA阻礙單核細胞的遷移.CD44介導底物HA對單核細胞遷移的