透明質(zhì)酸的性能及生產(chǎn)

1、透明質(zhì)酸的性能及生產(chǎn)趙春芳(武漢化工學(xué)院制藥系湖北武漢430073)摘要:敘述了生化藥物透明質(zhì)酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及兩種不同的生產(chǎn)方法。關(guān)鍵詞:生化藥物透明質(zhì)酸(HA)組織提取法發(fā)酵法中圖分類號:TQ46411文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:10040404(2000)03004302收稿日期:20000331作者簡介:趙春芳(1964)女湖北襄樊人工程師1988年畢業(yè)于武漢鋼鐵學(xué)院在職攻讀華中理工大學(xué)生物化工碩士。生物技術(shù)是21世紀(jì)技術(shù)的核心它

2、是利用生物體或其組成部分發(fā)展產(chǎn)品的技術(shù)體系利用生物技術(shù)研究和開發(fā)的生化藥物有兩個基本特點(diǎn):(1)它來自生物體(2)是生物體的基本生化成分。生物技術(shù)藥物與生化藥物沒有嚴(yán)格的界限可以利用現(xiàn)代生化技術(shù)生產(chǎn)還可以用化學(xué)方法合成或修飾這些藥物均具有療效高、安全性強(qiáng)、生產(chǎn)污染小、原料取自天然、可生物利用等優(yōu)點(diǎn)。在人類面臨健康、資源、環(huán)境、人口危機(jī)的今日更顯出其獨(dú)有的魅力在制藥業(yè)已異軍突起而且生物技術(shù)制藥市場方興未艾[12]。透明質(zhì)酸是一種性能優(yōu)良的

3、生化物質(zhì)應(yīng)用極其廣泛[4～7]它的應(yīng)用開發(fā)和生產(chǎn)是目前生化藥界比較熱門的課題。1透明質(zhì)酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)和基本性質(zhì)透明質(zhì)酸Hyaluronicacid常常簡寫為HA又稱玻璃酸廣泛存在于動物的皮膚、臍帶、關(guān)節(jié)滑液、軟骨、眼玻璃體、雞冠、雞胚、卵細(xì)胞和血管壁中。HA是由(1→4)202D2葡糖醛酸2Β2(1→3)2D2N2乙酰葡糖胺的雙糖單位重復(fù)連接構(gòu)成的線性多糖。不同動物組織和細(xì)菌來源的HA無種屬差異由不同精制方法獲得的HA相對分子質(zhì)量不同但也

4、無種屬差異。HA分子在溶液中高度水合粘度隨相對分子質(zhì)量和質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈指數(shù)上升當(dāng)HA的鏈纏繞在一起時鏈之間發(fā)生相互作用形成螺旋線圈具有一定的機(jī)械強(qiáng)度。HA溶液具有高度粘彈性溶液的粘度明顯依賴于切變力同一濃度的溶液在高、低切變力下粘度可差數(shù)千倍。HA的獨(dú)特的流變學(xué)特性是其臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)之一。HA對人類及動物無抗原性。HA分子鏈的長度及分子量是不均一的相對分子質(zhì)量范圍為2105～7106雙糖單位數(shù)為300～11000對屬生物大分子。商品HA一般

5、為Na鹽形式透明質(zhì)酸鈉為白色纖維狀或粉末狀固體有較強(qiáng)的吸濕性溶于水不溶于有機(jī)溶劑醫(yī)用級相對分子質(zhì)量為10105～25105化妝品級為5105～15105。可降低HA溶液的粘度離子強(qiáng)度越高粘度下降越多。2HA的生產(chǎn)前已述及HA廣泛存在于動物的各種組織細(xì)胞間質(zhì)中但含量較低1934年美國的Meyer等首先從牛眼玻璃體中分離出該物質(zhì)隨著HA的用途日益增多HA的需求量增大組織提取法受原料來源的限制遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場需要。80年代中期日本已有發(fā)酵生產(chǎn)

6、HA的報道。我國從90年代開始HA的發(fā)酵法生產(chǎn)的小試。目前國內(nèi)有許多單位從事HA的研究與開發(fā)山東省生物研究所在研制生產(chǎn)HA方面做了一些前沿的工作。下面分別介紹提取法和發(fā)酵法生產(chǎn)HA。211動物組織提取法[8～10]公雞冠或牛眼玻璃體絞碎用丙酮或乙醇脫脂脫水風(fēng)干風(fēng)干品蒸餾水浸泡12～24h過濾濾液加入Υ(NaCl)=10%再加入等體積的氯仿處理3～5次水相調(diào)pH=715加胰蛋白酶37℃保溫24h含HA的混合液氯仿洗滌2～3次HA粗提液這樣

7、得到的HA粗提液往往會含有較多雜蛋白若用到醫(yī)學(xué)眼科等需進(jìn)一步分離純化有人實(shí)驗(yàn)用342000年第3期湖北化工D315大孔離子交換劑去離子水為淋洗液016moll1NaCl為洗脫液純化此粗提液純化產(chǎn)品雜蛋白的含量96104符合瑞典Pharmacia公司同類產(chǎn)品Healon的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。212發(fā)酵法生產(chǎn)[1112]①菌種的篩選:人們研究發(fā)現(xiàn)鏈球菌屬和多種細(xì)菌都有莢膜這種莢膜的主要成分是HA同時在這些細(xì)菌中也含有透明質(zhì)酸酶它使HA降解所以發(fā)酵法生

8、產(chǎn)HA的基礎(chǔ)是找到高產(chǎn)HA又不產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶的菌種?，F(xiàn)在人們一般用鏈球菌屬的C群用紫外光照射或誘變處理二次使菌種突變二次然后分離鑒別得到不產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶的變種。日本專利[13]報道的一種用NTG(N2甲基2N2硝基2N2亞硝基胍)誘變的方法:原始菌種從牛鼻粘膜分離得到經(jīng)鑒定為Β溶血型獸疫鏈球菌產(chǎn)HA也產(chǎn)透明質(zhì)酸酶。然后進(jìn)行兩步誘變:第一步用NTG處理后接種于血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)收集無Β溶血環(huán)的菌落得到不產(chǎn)生Β溶血素的變種:第二步再NTG處

9、理分離鑒別得到不產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶的變種。據(jù)報道經(jīng)處理誘變過和菌種發(fā)酵得到的產(chǎn)率高達(dá)617gl1分子量2106而未經(jīng)誘變的原菌種發(fā)酵產(chǎn)率僅為2gl1。國內(nèi)也有報道用獸鏈球菌通過亞硝基胍誘變處理獲得了一株高產(chǎn)的透明質(zhì)酸菌種T12[14]。②發(fā)酵法生產(chǎn)HA的一般工藝流程:試管菌種接入三角瓶中37℃振蕩培養(yǎng)12～18h接入已滅菌的種子罐中接種比例為1∶200培養(yǎng)12～18h鏡檢菌體生長良好無雜菌后接入已滅菌的發(fā)酵罐中接種比例為1∶10。發(fā)酵過程中

10、需要檢測的參數(shù)主要有pH值、溶氧量、葡萄糖含量、發(fā)酵液粘度、HA含量和菌體密度等。③發(fā)酵條件的選擇和生產(chǎn)監(jiān)控:應(yīng)采取什么樣的發(fā)酵條件需根據(jù)所使用的菌種通過實(shí)驗(yàn)摸索而定據(jù)報道較好的發(fā)酵條件為:培養(yǎng)基用MS液體基質(zhì)用酵母膏作氮源用玉米漿作碳源外加一定的谷氨酸和精氨酸采取有氧發(fā)酵但不同階段采用不同的溶氧量控制pH在610～815發(fā)酵溫度為37℃。另外培養(yǎng)發(fā)酵瓶中的葡萄糖含量是檢查菌體對糖的利用情況的指標(biāo)必要時補(bǔ)充一定的葡萄糖當(dāng)葡萄糖含量接近零

11、時為發(fā)酵終點(diǎn)。測定發(fā)酵液的粘度可直觀地反映出HA產(chǎn)率的高低。發(fā)酵后需加入殺菌劑或加熱滅活菌體后離心或過濾除菌濾液經(jīng)乙醇沉淀、氯代十六烷基吡啶(CPC)沉淀、超濾等方法進(jìn)行分離純化最后用有機(jī)溶劑沉淀、真空干燥制得產(chǎn)品。發(fā)酵法生產(chǎn)的HA具有產(chǎn)量不受原料資源限制且成本低、分離純化工藝簡捷、易于規(guī)?；a(chǎn)等特點(diǎn)是HA生產(chǎn)的發(fā)展方向。參考文獻(xiàn):[1]21世紀(jì)藥品市場將形成三足鼎立之格局[J]1中國醫(yī)藥雜志1999(3)1[2]張?zhí)烀駱s曉花等1生化

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15、nfang(WuhanInstituteofChemicalEngineeringWuhan430073China)Abstract:Thispaperrecountchemicalstructurequalitiestwoproductedmethedsofhyaluronicacid.Keywds:biochemistrymedicinehyaluronicacidtissuerecovermethodfermentmethod44