透明質(zhì)酸發(fā)酵法制備及其復(fù)合改性研究.pdf

1、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,簡稱HA)是一種重要的醫(yī)藥材料和化妝品原料,并被列為新資源食品。近年來,微生物發(fā)酵法已經(jīng)逐步取代了動物組織提取法,成為制備HA的主要方法。
　　 在發(fā)酵法制備HA的過程中,需要對大量發(fā)酵液樣品進行HA含量的測定。傳統(tǒng)的Bitter-Miur法測定步驟繁瑣,以濃硫酸.咔唑溶液為反應(yīng)試劑,具有一定危險性。本研究考察了十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium brom

2、ide,簡稱CTAB)與HA反應(yīng)產(chǎn)生混濁的特性,建立了CTAB比濁法:配制25 mg/ml的CTAB試液,選擇400 nm作為CTAB比濁法的吸收波長,在室溫下,將純化后的樣液與CTAB試液準確反應(yīng)10 min,各樣品的測定時間誤差控制在10 s以內(nèi),通過標準曲線測算出待測樣中HA含量。試驗表明,CTAB比濁法的準確度、精確度和靈敏度均高于Bitter-Muir法。除了蛋白質(zhì)外,其它雜質(zhì)對CTAB比濁法影響較小。該法安全性高,操作簡便快

3、捷,適合對大量發(fā)酵液樣品進行測定,適用于測定HA的分子量范圍為≥50000 Da。
　　 本研究以馬疫鏈球菌(Streptococcus equisimilis)為出發(fā)菌,通過紫外線和60Co-γ射線輻照相結(jié)合的方法對出發(fā)菌株進行誘變選育,篩選出無溶血性、HA產(chǎn)量和分子量均較高的突變株NC168,其HA產(chǎn)量為150.61 mg/L,分子量為677000 Da。突變株經(jīng)過多次傳代,HA產(chǎn)量和HA分子量保持穩(wěn)定,溶血性無回復(fù)突變現(xiàn)象

4、,為進一步研究發(fā)酵法生產(chǎn)HA打下了基礎(chǔ)。
　　 針對突變株NC168,通過單因素試驗和二次正交旋轉(zhuǎn)回歸試驗對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化,并建立了回歸模型:
　　 Y=174.76168+6.09122X3-9.26943X12-12.92694X22.-14.36237X32.-12.20569X42由此得到了最佳培養(yǎng)基:酵母膏30 g/L,蛋白胨20 g/L,葡萄糖5 g/L和MgSO4·7H2O1.5g/L,模型預(yù)測HA

5、產(chǎn)量為174.76 mg/L,,驗證試驗HA產(chǎn)量達到178.53/mL,模型能較好的預(yù)測HA產(chǎn)量。將此培養(yǎng)基應(yīng)用于5 L發(fā)酵罐,進行分批發(fā)酵試驗。研究表明:pH值,初糖濃度,溫度和攪拌速度對HA產(chǎn)量均有顯著影響。優(yōu)化的培養(yǎng)條件為:pH值為7.0,初糖濃度為30 g/L,溫度35℃,攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min。5 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵HA的產(chǎn)量可達3.0 g/L。在發(fā)酵條件優(yōu)化基礎(chǔ)上,以Logistic,Slogistic和Sgompertz

6、三種模型對菌體生長過程中生物量和HA產(chǎn)量進行非線性擬合,結(jié)果表明,生物量模型以Logistic模型擬合效果最佳,擬合方程為:y=2.933-2.849/1+(x/11.185)4.453,相關(guān)系數(shù)R2達到0.999;而在HA合成擬合中,以Slogistic模型最佳,擬合方程為:y=1.900/1+e-0.318(x-13.413),相關(guān)系數(shù)R2為0.996;在對基質(zhì)(葡萄糖)的消耗擬合中,采用DoseResp模型,擬合方程為:y=2.0

7、85+26.566/1+100.15x-2.80,相關(guān)系數(shù)R2為0.991。
　　 采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)沉淀與超濾相結(jié)合的方法對HA進行分離純化。將發(fā)酵液稀釋到HA含量為0.6-0.8 g/L,加入發(fā)酵液體積15％的CTAB溶液(質(zhì)量分數(shù)為10％),在35℃下沉淀1 h,將沉淀置于濃度為1.5 mol/L的NaCl溶液中解離4 h,選擇濃度為70％乙醇進行沉淀。經(jīng)上述處理后HA得率可達93.8％,HA中蛋白含量可

8、降至1.5％。選擇截留分子量為100 Kda的超濾膜對經(jīng)過季銨鹽沉淀得到的HA進行超濾,樣液濃度為0.02％-0.05％,過膜壓力為11 psi,HA得率可達到93.5％,蛋白去除率達到94.0％。經(jīng)分離純化后,HA總得率為87.7％,HA中蛋白含量可降至0.09％,葡萄糖醛酸含量可達43.5％,達到醫(yī)藥級水平。
　　 為了獲得性能良好的HA水凝膠,選擇分子量為1500000 Da的HA與海藻酸鈉(sodium alginate

9、,簡稱SAL)進行復(fù)合改性。以醋酸鹽緩沖液作為調(diào)節(jié)pH的試劑,碳化二亞胺(EDC)作為羧基激活劑,已二酰肼(ADH)作為交聯(lián)劑,制備了HA-SAL復(fù)合水凝膠。通過紅外光譜驗證了HA與SAL之間形成的酰胺鍵,通過電鏡觀察了所形成凝膠的微結(jié)構(gòu)。質(zhì)構(gòu)特征分析表明,凝膠的硬度隨著兩種多糖濃度升高而增加,隨著HA/SAL摩爾比例升高而減小。凝膠的溶脹率與HA的比例成正相關(guān),而與EDC用量成負相關(guān)。隨著SAL比例和EDC用量的增加,所形成凝膠的抗透