基于外周血多參數(shù)聯(lián)合分析作為女性惡性腫瘤分子診斷方法的研究.pdf

1、目的:探索基于血清多參數(shù)聯(lián)合診斷用于鑒別女性惡性腫瘤與健康對(duì)照組的診斷價(jià)值，為臨床診斷提供一種分子輔助診斷方法。按照生物信息學(xué)方向流動(dòng)，從不同的視角研究探索女性惡性腫瘤尤其是卵巢癌及乳腺癌的診斷模式，試圖篩選高靈敏、高特異的新的腫瘤生物標(biāo)志物。
　　方法:收集卵巢腫瘤(Ovarian tumors)158例、卵巢癌（ovarian cancer）137例，卵巢良性腫瘤13例、卵巢交界性腫瘤8例及健康對(duì)照組40例，乳腺癌60例，乳腺

2、良性腫瘤20例，建立臨床數(shù)據(jù)庫。①流行病學(xué)調(diào)查及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析卵巢癌臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的差異;對(duì)生化指標(biāo)及腫瘤標(biāo)記物CA125及其余腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行生物信息學(xué)分析。②采用曠博三步法的免疫熒光定量PCR方法測(cè)量乳腺癌中血清miRNA水平，分析了不同組間miRNA表達(dá)的差異。首先應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的miRNA提取方法。設(shè)定miRNA的內(nèi)參、質(zhì)控，在第一步，加多聚A尾，在miRNA和其他非編碼RNA分子的3'端。第二步，反轉(zhuǎn)錄miRNA為cDNA的并在5'端加特

3、異性標(biāo)簽。最后，在一個(gè)特異性的miRNA的正向引物和反向通用引物組合的進(jìn)行qPCR反應(yīng)，并測(cè)量;③用基質(zhì)輔助激光解離時(shí)間飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)繪制卵巢癌蛋白多肽圖譜，用MB-WCX磁珠優(yōu)化處理外周血清標(biāo)本，用Clinprot軟件分析卵巢癌與健康對(duì)照的蛋白多肽差異，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)分析，分別分析比較了卵巢癌不同分期、分級(jí)及病理類型的多肽表達(dá)差異;④Luminex液態(tài)芯片檢測(cè)血清中炎性因子GM-CSF、IFN-γ、GRO、I

4、L-1β、IL-2、IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α、VEGF、 EGF、RANTES、 CCL21/6Ckine和SDF-1/CXCL12等指標(biāo)，比較其在卵巢漿液性上皮癌與健康對(duì)照組的差異，并探討其作為腫瘤標(biāo)志物的預(yù)測(cè)價(jià)值。數(shù)據(jù)資料用SPSS19.0計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件及ClinPro Tools軟件分析。
　　結(jié)果:①建立臨床數(shù)據(jù)庫;回顧分析了卵巢癌患者的病史資料特點(diǎn)，女性腫瘤標(biāo)志物CEA,AFP, CA125,CA199

5、,CA153,CA724,SCC,NSE,HCG, CYFRA21-1,Ferr在卵巢癌組顯著上調(diào)，CA125表達(dá)最顯著，但僅有54％的患者CA125表達(dá)陽性，CA125表達(dá)陽性率隨期別升高而增高。CA153在診斷卵巢與健康對(duì)照組時(shí)的曲線下面積達(dá)到0.827，敏感性80.3％，但是，特異性為72.6％。CA125敏感性僅為64.3％，但特異性好，特異度為90.4％。CA125與CA153聯(lián)合診斷的曲線下面積可以達(dá)到0.877，敏感度上升

6、73.5％，而仍然保持良好的特異度90.5％。一些與代謝有關(guān)的生化指標(biāo)顯著升高。如GGT、HDL、CK-MB、CO2、ALP、TG、CK-MB、均高于健康對(duì)照組。②miR-451，miR-148a，miR-27a，和miR-30b在乳腺癌患者血清中表達(dá)下調(diào)(miR-451:P=0.000; miR-148a: P=0.021; miR-27a: P=0.013 andmiR-30b: P=0.001)。miR-451，miR-27a和m

7、iR-30b在乳腺良性疾病中也下調(diào)miR-451:P=0.002; miR-27a: P=0.012和miR-30b: P=0.046。其中miR-451在這些指標(biāo)中被認(rèn)為敏感度最高，表達(dá)差異最大，可以被用來進(jìn)行乳腺疾病與健康對(duì)照組的初篩，miR-148a在區(qū)別卵巢良性腫瘤和惡性腫瘤時(shí)有一定的意義。miR-451，miR-148a，miR-27a和miR-30b作為標(biāo)志物集用于診斷乳腺癌，ROC工作曲線下面積可達(dá)到0.953，敏感性94

8、.7％，特異性82.8％。單一的miR-148a在區(qū)分卵巢良惡性腫瘤時(shí)，能夠達(dá)到56.1％的敏感性，78.9％的特異性，曲線下面積達(dá)69.8％。③卵巢癌不同病理類型、不同分期及分級(jí)的差異蛋白。4個(gè)差異多肽與卵巢癌的分級(jí)有關(guān)，分別為2884.4Da，2899.9 Da，3542.9 Da，2864.6 Da。其中2884.4Da峰差異最顯著，在高分化的卵巢癌中表達(dá)較高，在中分化、低分化組中表達(dá)明顯下調(diào)。8個(gè)多肽峰與卵巢癌的分期有關(guān)，在晚期

9、癌癥中表達(dá)上調(diào)的是2683.5Da，2661.3 Da，2670.6 Da，2952.0 Da，表達(dá)下調(diào)的是1532.7 Da，1980.3Da，2884.4 Da，1804.7 Da。同源的腫瘤，差異表達(dá)的多肽也少。建立回歸方程Y=0.691+0.398X2487-0.638 X1867，診斷價(jià)值最高，ROC曲線下面積為0.855，敏感度可達(dá)100％,特異度達(dá)到60.9％, Youden指數(shù)0.609。④卵巢癌組EGF, IL-6，M

10、CP-1，6Ckine的血清中值水平明顯升高，與健康對(duì)照組比較，而IL-2的血清水平在卵巢癌中下降。根據(jù)差異表達(dá)的各項(xiàng)因子多因素回歸后建立診斷方程Y=-3.707+0.009 XEGF+0.001XMCp+0.014 XCkine，診斷模型的敏感度為72.7％，特異度為83.8％，ROC曲線下面積為0.845。
　　結(jié)論:以女性腫瘤卵巢癌、乳腺癌臨床數(shù)據(jù)資料為基礎(chǔ)，采用目前比較前沿的分子診斷技術(shù)，整合基因組學(xué)、蛋白組學(xué)技術(shù)的生物信