惡性腫瘤功能基因分析方法的應(yīng)用研究.pdf

1、隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生命分析化學(xué)的發(fā)展，“后基因組時(shí)代”功能基因組學(xué)的研究不斷深入，越來越多的促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的基因被人類所認(rèn)識(shí)。本論文圍繞腫瘤基因功能的甄定、基因表達(dá)水平的檢測、基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的規(guī)律等方面開展研究。
　　1.人卵巢癌組織中UHRF1基因檢測與分析
　　化學(xué)合成針對UHRF1基因的siRNA或shRNA干擾片段，將其轉(zhuǎn)入卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3、OVCAR-3、HO-8910和HO-8910 P

2、M，抑制其在細(xì)胞株中的表達(dá)，探索UHRF1基因在卵巢癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和Western blot驗(yàn)證RNAi的沉默效果;CCK-8試驗(yàn)檢測UHRF1基因沉默前后細(xì)胞增殖水平的變化。流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst33342檢測細(xì)胞的凋亡水平。Transwell小室試驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力。用Westem blot技術(shù)檢測HO-8910和HO-8910 PM細(xì)胞周期蛋白Cyclin D2，Cyclin

3、 E，Cyclin B1的表達(dá)。用流式細(xì)胞術(shù)檢測HO-8910和HO-8910 PM細(xì)胞株UHRF1基因沉默前后細(xì)胞周期分布的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制UHRF1基因在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)，細(xì)胞的生長能力和侵襲能力減弱，細(xì)胞凋亡增加;UHRF1敲減后，HO-8910細(xì)胞發(fā)生了G2/M期阻滯，Cyclin B1蛋白的表達(dá)增加。該研究表明UHRF1基因是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的功能癌基因。
　　2.卵巢癌細(xì)胞株UHRF1基因功能分析方法的應(yīng)用研

4、究
　　應(yīng)用RT-PCR和Western-blot技術(shù)，研究UHRF1在卵巢癌組織中的表達(dá)。采用免疫組織化學(xué)方法，檢測上皮性卵巢癌良性腫瘤組織和上皮性卵巢癌組織中UHRF1陽性表達(dá)并分析其與患者的年齡、卵巢癌臨床分期、細(xì)胞分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為卵巢癌的診療和評估預(yù)后提供理論依據(jù)。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，UHRF1 mRNA和蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)高于對應(yīng)的癌旁組織(P＜0.01;P＜0.05);免疫組

5、織化學(xué)結(jié)果顯示，卵巢癌良性腫瘤組織中UHRF1表達(dá)陽性率為6.67％(1/15)，卵巢癌組織中陽性率為42.86％(24/56)。卵巢癌組織中UHRF1陽性率高于卵巢良性腫瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);分析56例石蠟包埋卵巢癌組織塊的臨床病理資料發(fā)現(xiàn)，UHRF1的表達(dá)與卵巢癌的分級有關(guān)(P＜0.05)，而與患者的年齡、腫塊的大小以及腫瘤的分期和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移無關(guān)(P＞0.05)。結(jié)果提示UHRF1基因有望發(fā)展成為新的腫瘤標(biāo)志

6、物。
　　3.乳腺癌細(xì)胞株周期蛋白Cyclin Y檢測分析
　　細(xì)胞周期蛋白Cyclin Y(CCNY)能夠與腫瘤相關(guān)基因PFTK1相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長。本論文分析了65例乳腺癌組織和4株乳腺癌細(xì)胞系BT-474，MDA-MB-231，T-47D and MCF-7中CCNY的表達(dá)水平。應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的ShRNA抑制細(xì)胞周期蛋白Y在兩種乳腺癌細(xì)胞mda-mb-231和MCF-7中的表達(dá)。MTT比色法、克隆形成試驗(yàn)和流

7、式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞生長情況。CCNY敲除導(dǎo)致細(xì)胞增殖和克隆形成能力顯著減少，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，在mda-mb-231細(xì)胞中，敲除細(xì)胞周期蛋白Cyclin Y導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，表明Cyclin Y可以直接參與G1/S期的調(diào)控。進(jìn)一步探索細(xì)胞周期蛋白Cyclin Y在調(diào)控乳腺癌細(xì)胞生長過程中潛在的分子機(jī)制。對細(xì)胞周期蛋白Cyclin Y的敲除，增強(qiáng)了一些蛋白的磷酸化如Bad，p53，GSK3β以及PARP和caspase

8、-3的剪切體。促凋亡蛋白質(zhì)Bad的磷酸化能夠抑制細(xì)胞增殖以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，然而如果Bad蛋白受到抑制則能夠增加細(xì)胞的生長速率。多功能激酶GSK-3β在絲氨酸Ser9(22、23)的磷酸化卻抑制了其活性。GSK-3β蛋白的抑制作用反而促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。caspase-3和PARP剪切體含量的增加是指示細(xì)胞凋亡的可靠指標(biāo)。這些表明，細(xì)胞周期蛋白Cyclin Y的敲除可能通過激活某些蛋白來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，比如活性蛋白Bad，GSK-3β，