新型組蛋白去乙?；敢种苿┑脑O(shè)計(jì)、合成及抗腫瘤活性研究.pdf

1、本研究論文是以在生物表觀遺傳學(xué)研究過程中發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移以及腫瘤組織新生血管生成密切相關(guān)的生物靶標(biāo)組蛋白去乙酰化酶(HDACs)為作用靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了三個(gè)系列共計(jì)109個(gè)具有全新骨架結(jié)構(gòu)的HDACs抑制劑，并對(duì)其進(jìn)行了體內(nèi)外生物活性評(píng)價(jià)和構(gòu)效關(guān)系討論。全文共分為五個(gè)部分進(jìn)行分章論述。
　　 一.研究背景
　　 腫瘤(tumor)是僅次于心腦血管疾病的嚴(yán)重威脅人類生命健康的第二大殺手。目前，我國(guó)惡性腫瘤的發(fā)病率

2、以每年2.5％的速度增長(zhǎng)，死亡率每年遞增約1.3％。
　　 組蛋白去乙?；?HDACs)是一類催化各種底物（如核小體組蛋白）賴氨酸殘基末端的乙?；獾牡鞍酌讣易濉Ｄ壳鞍l(fā)現(xiàn)的人源HDACs包括4個(gè)亞族共18個(gè)亞型。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，許多HDACs家族成員的表達(dá)和活性在多種腫瘤病例中都有上調(diào)的表現(xiàn)，這表明HDACs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近來，越來越多的研究表明，HDACs通過使組蛋白末端的賴氨酸殘基去乙?；瘉硪种苹?/p>

3、轉(zhuǎn)錄，并通過去乙酰化多種非組蛋白而影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和定位、蛋白質(zhì)-DNA相互作用及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，這其中很多效應(yīng)都會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。HDACs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中主要起以下幾方面的作用:1.促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲遷移;2.促進(jìn)腫瘤組織新生血管生成;3.增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療化療藥物的耐藥性;4.抑制腫瘤細(xì)胞分化和凋亡等。
　　 隨著HDACs與腫瘤密切關(guān)系的逐步闡明，越來越多的HDACs抑制劑顯示出了高效的體內(nèi)外抗

4、腫瘤活性和多重的抗腫瘤作用機(jī)制，如:誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬、引起腫瘤細(xì)胞周期阻滯、抑制腫瘤細(xì)胞血管生成、降低腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和遷移能力、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療和化療的敏感性、降低腫瘤細(xì)胞DNA的自我修復(fù)能力等。迄今為止，已有兩個(gè)HDACs抑制劑（SAHA和FK228）被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤。此外，目前還有十余種HDACs抑制劑進(jìn)入了臨床研究，用于淋巴瘤，實(shí)體瘤和其它血液系統(tǒng)腫瘤的治療。因此，尋找高效、

5、低毒的小分子HDACs抑制劑已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外抗癌領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
　　 雖然已知的HDACs抑制劑的結(jié)構(gòu)類型豐富多樣，但絕大部分抑制劑都符合一個(gè)通用的藥效團(tuán)模型，該藥效團(tuán)模型主要分為三部分:分別位于兩端的鋅離子螯合基團(tuán)(ZBG)和酶表面識(shí)別區(qū)域(SurfaceRecognitionDomain)，以及將以上兩部分連接起來的適當(dāng)長(zhǎng)度的疏水性長(zhǎng)鏈(Linker)。本論文根據(jù)已知的HDACs抑制劑的藥效團(tuán)模型和酶活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)信息，合理

6、設(shè)計(jì)、定向合成具有全新結(jié)構(gòu)的HDACs抑制劑，從中篩選、優(yōu)化得到具有體內(nèi)外抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物，為進(jìn)一步開發(fā)具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新性抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。
　　 二.以四氫異喹啉-3-羧酸為骨架結(jié)構(gòu)的異羥肟酸類組蛋白去乙?；敢种苿┑脑O(shè)計(jì)、合成及抗腫瘤活性研究
　　 針對(duì)HDACs抑制劑藥效團(tuán)模型的三個(gè)部分進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造是獲得HDACs抑制劑的有效策略之一。本部分將構(gòu)象限定這一經(jīng)典策略用于HDACs抑制劑疏水性長(zhǎng)鏈(L

7、inker)的結(jié)構(gòu)改造當(dāng)中。通過對(duì)化合物進(jìn)行構(gòu)象限定，一方面可以獲得化合物的藥效構(gòu)象，提高化合物對(duì)其作用靶點(diǎn)的分子識(shí)別作用，降低由于化合物脫靶而引起的毒副作用;另一方面可以一定程度上提高化合物的代謝穩(wěn)定性。這都有利于獲得高效、低毒、代謝穩(wěn)定的HDACs抑制劑。
　　 通過文獻(xiàn)調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)1，2，3，4-四氫異喹啉-3-羧酸（簡(jiǎn)稱Tic）是一種具有獨(dú)特幾何構(gòu)象和生物活性的非天然α。氨基酸。Tic的結(jié)構(gòu)片段被用于許多活性化合物的設(shè)

8、計(jì)與合成。本部分創(chuàng)新性地將Tic片段引入HDACs抑制劑藥效團(tuán)結(jié)構(gòu)中的Linker部分，結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)手段，經(jīng)過幾輪的活性評(píng)價(jià)篩選（體外抑酶活性篩選、體外抗腫瘤細(xì)胞增殖活性篩選和動(dòng)物體內(nèi)抑瘤活性篩選）和結(jié)構(gòu)優(yōu)化改造，共設(shè)計(jì)合成66個(gè)四氫異喹啉-3-羧酸系列的HDACs抑制劑，化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)過1HNMR、HRMS和IR確證，活性優(yōu)秀的化合物的純度經(jīng)HPLC測(cè)試大于等于95％。經(jīng)查閱文獻(xiàn)證實(shí)，所合成的目標(biāo)化合物均為新型化合物，未見文獻(xiàn)或

9、專利報(bào)道。
　　 考慮到各種Zn2+依賴性HDACs亞型的活性位點(diǎn)具有高度的保守性，而HDAC8的活性位點(diǎn)晶體結(jié)構(gòu)已知，我們首先采用HDAC8作為酶源對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行篩選，對(duì)抑酶活性較好的化合物進(jìn)一步進(jìn)行體外抗腫瘤細(xì)胞增殖活性篩選和動(dòng)物體內(nèi)抑瘤活性篩選。絕大多數(shù)目標(biāo)化合物的體外抑酶活性優(yōu)于己上市的陽性對(duì)照藥SAHA，部分目標(biāo)化合物對(duì)多株腫瘤細(xì)胞具有顯著的抗增殖活性，其中化合物13e，22a和22c顯示出與陽性對(duì)照藥SAHA相當(dāng)甚

10、至更強(qiáng)的裸鼠體內(nèi)抗人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)、抗人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116)增殖活性和雜種鼠體內(nèi)抗肝癌細(xì)胞(H22)肺轉(zhuǎn)移活性。本系列活性最強(qiáng)的化合物22c，由于其明顯優(yōu)于SAHA的體內(nèi)外抗腫瘤活性，己被作為抗癌候選藥物進(jìn)行臨床前研究與開發(fā)。
　　 三.以酪氨酸為骨架結(jié)構(gòu)的異羥肟酸類組蛋白去乙?；敢种苿┑脑O(shè)計(jì)、合成及抗腫瘤活性研究
　　 上述系列中設(shè)計(jì)得到的四氫異喹啉-3-羧酸系列HDACs抑制劑有效的HDA

11、Cs抑酶活性和體內(nèi)外抗腫瘤活性激發(fā)了我們對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化的熱情。為了考察分子柔性對(duì)活性的影響，本章采用相對(duì)柔性的酪氨酸結(jié)構(gòu)片段代替四氫異喹啉-3-羧酸系列HDACs抑制劑骨架結(jié)構(gòu)中的剛性四氫異喹啉-3-羧酸結(jié)構(gòu)片段。設(shè)計(jì)合成的13個(gè)酪氨酸系列化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)過1HNMR和HRMS確證。經(jīng)查閱文獻(xiàn)證實(shí)，所合成的目標(biāo)化合物均為新型化合物，未見文獻(xiàn)或?qū)＠麍?bào)道。
　　 我們首先對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行了HDAC8的抑酶活性篩選和體外人乳

12、腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)、肺癌細(xì)胞(A549)和結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT116)的抗增殖活性篩選，結(jié)果表明酪氨酸系列化合物與四氫異喹啉-3-羧酸系列化合物相比，有較強(qiáng)的HDAC8抑酶活性和較弱的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性。其中，目標(biāo)化合物Q1、Q2、Q3和Q4的HDAC8抑酶活性比SAHA強(qiáng)10倍以上。進(jìn)一步的以HeLa細(xì)胞核提取物為酶源（主要含HDAC1和HDAC2）的測(cè)試結(jié)果表明，化合物Q1-Q4的活性明顯差于SAHA，這可能是該系列化合

13、物抗腫瘤細(xì)胞增殖活性較差的原因，因?yàn)檠芯勘砻鱄DAC1和HDAC2的活性與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)。這些結(jié)果提示我們酪氨酸衍生物類HDACs抑制劑具有一定的HDAC8亞型選擇性，有希望進(jìn)一步設(shè)計(jì)改造成為高選擇性的HDAC8選擇性抑制劑。
　　 四.以1，4-二硫-7-氮雜螺[4,4]壬烷-8-羧酸為骨架結(jié)構(gòu)的直鏈異羥肟酸類組蛋白去乙?；敢种苿┑脑O(shè)計(jì)、合成及抗腫瘤活性研究
　　 根據(jù)已知的HDACs抑制劑的藥效團(tuán)模型，結(jié)合經(jīng)

14、典的類肽化合物作為酶抑制劑的設(shè)計(jì)策略，我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列直鏈類異羥肟酸化合物。我們將1，4-二硫-7-氮雜螺[4，4]壬烷-8-羧酸活性片段引入HDACs抑制劑藥效團(tuán)模型的酶表面識(shí)別區(qū)域(SurfaceRecognitionDomain)，以考察該部分對(duì)化合物活性和選擇性的影響。合成得到的30個(gè)1，4-二硫-7-氮雜螺[4，4]壬烷-8-羧酸系列化合物結(jié)構(gòu)均經(jīng)過1HNMR和HRMS確證，部分代表性化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)過13CNMR確證。經(jīng)查閱文獻(xiàn)

15、證實(shí)，所合成的目標(biāo)化合物均為新型化合物，未見文獻(xiàn)或?qū)＠麍?bào)道。
　　 我們首先對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行了HDAC8的抑酶活性篩選，結(jié)果表明該系列化合物普遍具有較強(qiáng)的HDAC8抑制活性。值得指出的是，目標(biāo)化合物33f、331、341、33k、33m和33n的HDAC8抑酶活性明顯優(yōu)于上市藥物SAHA，其中化合物331和33k的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別達(dá)到0.021±0.004mmol和0.035±0.007mmol，然而該系列化合物的抗

16、腫瘤細(xì)胞增殖活性（人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7和人前列腺癌細(xì)胞PC-3）卻遠(yuǎn)不及SAHA.后續(xù)的HDAC1抑酶活性測(cè)試結(jié)果提示我們，化合物331和33k具有一定的HDAC8亞型選擇性，可以作為先導(dǎo)化合物用來設(shè)計(jì)得到全新的具有亞型選擇性的HDACs抑制劑。
　　 五.全文總結(jié)與展望
　　 本課題綜合運(yùn)用藥物化學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、計(jì)算機(jī)化學(xué)等前沿學(xué)科的交叉，以當(dāng)前抗腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)組蛋白去乙?；窰DACs為靶

17、標(biāo)，合理設(shè)計(jì)、定向合成了三個(gè)系列共109個(gè)具有全新骨架結(jié)構(gòu)的HDACs抑制劑。對(duì)所有目標(biāo)化合物進(jìn)行了分子水平的抑酶活性篩選，從中選取活性較好的化合物逐層進(jìn)行細(xì)胞水平、動(dòng)物水平的抗腫瘤活性測(cè)試，利用得到的構(gòu)效關(guān)系信息對(duì)表現(xiàn)優(yōu)異的化合物進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改造、修飾和優(yōu)化。結(jié)果表明:四氫異喹啉-3-羧酸衍生物骨架結(jié)構(gòu)可以用來設(shè)計(jì)、合成具有體內(nèi)外抗腫瘤活性的廣譜HDACs抑制劑，目前得到的化合物22c的體內(nèi)外抗腫瘤活性明顯優(yōu)于上市藥物SAHA，對(duì)