豬脂肪細(xì)胞分化、脂肪沉積相關(guān)候選基因的分離、定位及遺傳效應(yīng)分析.pdf

1、脂肪組織是一種高度分化的組織，在胚胎發(fā)育晚期出現(xiàn)，出生后迅速增長(zhǎng)。脂肪組織的生長(zhǎng)包括新脂肪細(xì)胞的生成(即脂肪細(xì)胞分化)和脂肪細(xì)胞體積的增大。脂肪細(xì)胞增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(AEBPl)是在小鼠的肥胖研究中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄抑制因子。在脂肪組織脂肪酸結(jié)合蛋白(aP2)基因啟動(dòng)子鄰近區(qū)域AE-1存在AEBPl的識(shí)別區(qū)域，而aP2基因編碼的蛋白可以作為脂肪細(xì)胞分化的標(biāo)志。小鼠AEBPl基因通過(guò)選擇性剪接形成兩種轉(zhuǎn)錄本AEBPl和AC

2、LP(主動(dòng)脈羧肽酶類樣蛋白)，其編碼的兩種蛋白AEBPl和ACLP功能完全不同。目前，豬AEBPl基因的序列、結(jié)構(gòu)和功能尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究首次利用電子克隆技術(shù)結(jié)合PCR，對(duì)豬AEBPl基因的部分cDNA和DNA序列進(jìn)行了分離和測(cè)序，并對(duì)不同品種的豬AEBPl基因序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析：利用豬輻射雜種克隆板(IMpRH)對(duì)豬AEBPl基因進(jìn)行了染色體精細(xì)定位；利用RT-PCR方法對(duì)豬AEBPl基因是否存在不同轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了鑒定，并分別對(duì)其

3、推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的基本特征，同時(shí)在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)了不同轉(zhuǎn)錄本在豬的各個(gè)組織表達(dá)分布情況。 為了確定豬脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因AEBPI和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)基因，脂肪沉積候選基因黑素皮質(zhì)素-4受體(MC4lR)基因、黑素皮質(zhì)素-5受體(MC5R)基因和胰島素樣生長(zhǎng)因子-2(IGF2)基因以及肌內(nèi)脂肪含量候選基因PRKAG3的遺傳學(xué)效應(yīng)，以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)豬場(chǎng)2002年屠宰的大白、長(zhǎng)白

4、和梅山豬等三個(gè)品種和大白×長(zhǎng)白、長(zhǎng)白×大白、大白×梅山、梅山×大白豬(以下分別簡(jiǎn)稱大長(zhǎng)、長(zhǎng)大、大梅、梅大)等四個(gè)雜交組合群體(共336頭)以及2003、2004年屠宰的大白×梅山豬F<,2>代群體(共290頭)為試驗(yàn)材料，利用：PCR-RFLP分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)豬AEBPI、PPAR γ、MC4R、MC5R、IGF2和PRKAG3進(jìn)行了基因型分型，并與背膘厚等胴體性狀、肌內(nèi)脂肪含量等肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析；此外，為了篩選更多的SNP，對(duì)豬

5、脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因脂肪細(xì)胞定向和分化因子(ADDll基因的不同豬品種DNA進(jìn)行分離、測(cè)序并進(jìn)行序列比對(duì)，取得了以下結(jié)果： 1．豬AEBPl基因cDNA和DNA序列的分離、測(cè)序和序列分析：以人AEBPl基因序列作為探針，在NCBI的EST數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)得到豬EST序列并進(jìn)行拼接。 2.豬AEBPl和PNPLA2基因的染色體精細(xì)定位：根據(jù)豬AEBPl基因DNA序列設(shè)計(jì)引物AE-MAP F和AE-MAP R，利用豬輻射雜種克隆

6、板把豬AEBPl基因定位于SSCl8q24。兩點(diǎn)連鎖分析發(fā)現(xiàn)與豬AEBPl基因連鎖最緊密的標(biāo)記是S0177(LOD=24.47，6cR)，多點(diǎn)分析結(jié)果為SWl808-SW2540-TCRB-SWl984-SW787-SWl682-S0062-S0120-AEBPl-S0177-SWR414-SWRl69。 3．豬AEBPl/ACLP轉(zhuǎn)錄本鑒定：分別在豬AEBPl基因第8外顯子、第9內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)兩條上游引物(P8、P9)，第10

7、、11外顯子設(shè)計(jì)兩條下游引物(P10、P11)，通過(guò)不同引物組合P8-Pll、P9-P10和P9-Pll，以豬脂肪組織cDNA為模板擴(kuò)增到大小不同的片段。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，序列分析確定不同帶型分別代表豬AEBPl的兩種轉(zhuǎn)錄本AEBPl和ACLP。 4．豬AEBPl/ACLP轉(zhuǎn)錄本推導(dǎo)的蛋白質(zhì)基本特征分析：通過(guò)相似性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，推導(dǎo)的豬AEBPl氨基酸序列與小鼠AEBPl的相似性為95％；推導(dǎo)的豬ACLP氨基酸序列與人和小鼠ACL

8、P的相似性分別為90％和86％。PSORT軟件分析推導(dǎo)的豬AEBPl和ACLP蛋白可能都位于細(xì)胞質(zhì)中。 5. 轉(zhuǎn)錄水平組織表達(dá)譜分析：利用RT-PCR方法分別檢測(cè)到豬AEBPl/ACLP轉(zhuǎn)錄本在豬的脂肪、肌肉、心、肝、脾、肺、腎、子宮、睪丸、胚胎、小腸和胃等12個(gè)組織中的表達(dá)情況。除ACLP轉(zhuǎn)錄本在小腸中未表達(dá)外，AEBPl和ACLP轉(zhuǎn)錄本在各個(gè)組織中均有表達(dá)，但表達(dá)豐度不一?？傮w而言，除肝臟和小腸外，AEBPl在各種組織中的豐

9、度均低于ACLP。 6. 豬脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因AEBPl、PPARγ)，的性狀關(guān)聯(lián)分析：AEBPl基因內(nèi)含子9第324位C→A變異引起PstI酶切多態(tài)性:PPARγ)，第175位A→G變異引起氨基酸改變(Met→Val)，并引起B(yǎng)stI酶切多態(tài)性。 7. 豬脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因ADDl部分DNA序列的SNPs篩查：根據(jù)豬ADDJ基因mRNA序列設(shè)計(jì)引物，分別以大白和梅山豬DNA作為模板擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物測(cè)序后經(jīng)序列比對(duì)發(fā)

10、現(xiàn)了8個(gè)潛在的SNPs，其中三個(gè)位于外顯子區(qū)域，但沒(méi)有引起氨基酸改變。將大白豬ADDl基因DNA序列提交GenBank，獲得登錄號(hào)DQ464433。 8.豬脂肪沉積相關(guān)候選基因MC4R、MC5R和IGF2的性狀關(guān)聯(lián)分析：MC4R基因G_A變異引起298位氨基酸改變(Asp→Asn))，并引起TaqI酶切多態(tài)性；MC5R基因G→A變異引起109位氨基酸改變(Ala→Thr)，并引起B(yǎng)saHI酶切多態(tài)性；IGF2基因內(nèi)含子8的一個(gè)G

11、→C突變引起B(yǎng)cn，酶切多態(tài)性。 9．肌內(nèi)脂肪及糖原合成與代謝候選基因PRKAG3的性狀關(guān)聯(lián)分析：PRKAG3基因兩處堿基變異分別導(dǎo)致52和199位氨基酸改變(Gly52Ser、Ilel99Val)，并分別引起Hphl．BsaHl酶切多態(tài)性。在大白、長(zhǎng)白和梅山豬等三個(gè)品種和大長(zhǎng)、長(zhǎng)大、大梅、梅大豬等四個(gè)雜交組合群體分別進(jìn)行PCR-Hph I-RFLP和PCR-BsaHo l-RFLP酶切分型，發(fā)現(xiàn)工199V位點(diǎn)在各個(gè)群體中I等位