食淀粉乳桿菌調(diào)節(jié)小鼠腸道GM3在抗RV感染中的作用.pdf

1、輪狀病毒(Rotavirus，RV)屬于呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，是引起幼畜病毒性腸炎、腹瀉的的主要病原之一，對我國養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，神經(jīng)節(jié)苷酯GM3是其主要受體之一。
　　為了探討食淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus)在抗豬輪狀病毒(Procine Rotavirus，PRV)作用中GM3的調(diào)節(jié)機制，本研究分別完成了食淀粉乳桿菌體外抗RV能力分析;食淀粉乳桿菌體內(nèi)對RV感染小鼠乳鼠的相關(guān)效應(yīng)和乳鼠空腸神經(jīng)

2、節(jié)苷脂GM3變化規(guī)律等兩方面研究，旨在闡明食淀粉乳桿菌抗RV部分機制。
　　本研究分為體外和動物體內(nèi)兩個部分。體外實驗以IPEC-J2細胞為細胞平臺、MTT法為檢驗方法分析食淀粉乳桿菌體外抗RV能力;體內(nèi)實驗選擇中國昆明鼠乳鼠作為實驗動物，檢測食淀粉乳桿菌體內(nèi)對RV感染小鼠乳鼠的相關(guān)效應(yīng)，進一步檢測了乳鼠空腸神經(jīng)節(jié)苷脂GM3變化規(guī)律和上述效應(yīng)相關(guān)性。
　　一、體外試驗部分。主要包括食淀粉乳桿菌上清液抗RV能力穩(wěn)定性研究和益生

3、菌共培養(yǎng)上清液抗RV能力測定兩個方面:
　　1.食淀粉乳桿菌上清液抗RV能力穩(wěn)定性研究:連續(xù)將食淀粉乳桿菌傳代25次，每隔3代測定其上清抗RV能力，測定結(jié)果顯示:各代食淀粉乳桿菌對RV抑制率差異不顯著，表明該株食淀粉乳桿菌菌株抗RV能力較為穩(wěn)定，具有較為良好的傳代穩(wěn)定性。
　　2.益生菌共培養(yǎng)上清液抗RV能力測定:選取食淀粉乳桿菌和抗RV能力不等的4株屎腸球菌為實驗材料，探究該株食淀粉乳桿菌與不同株屎腸球菌共培養(yǎng)后，共培養(yǎng)上

4、清液抗RV能力與單獨食淀粉上清液及單獨屎腸球菌上清液抗RV能力間的差異。實驗結(jié)果顯示:z4、z5和z8與食淀粉乳桿菌混合培養(yǎng)后上清液抗RV能力，介于單獨食淀粉乳桿菌和單獨z4、z5和z8上清液抗RV能力之間，差異不顯著(p＞0.05)。z7和食淀粉乳桿菌共培養(yǎng)上清液對RV抑制率均低于單獨屎腸球菌上清及單獨食淀粉乳桿菌上清。說明該株食淀粉乳桿菌有良好的共培養(yǎng)穩(wěn)定性。
　　二、體內(nèi)實驗部分。主要包括食淀粉乳桿菌體內(nèi)對RV感染小鼠乳鼠的

5、相關(guān)效應(yīng)和食淀粉乳桿菌對乳鼠空腸神經(jīng)節(jié)苷脂GM3作用兩方面。試驗乳鼠分為4組:正常組、病毒組、先灌胃益生菌后攻毒組-食淀粉組(Gavaged probiotic before inoculation group，BI group)和先攻毒后灌胃益生菌組-治療組(Gavaged probiotic after inoculation group，AI group)，26只每組，共飼喂11天(d)，從1d開始BI組每只每天灌胃50μL益生菌

6、活菌液(106cfu/mL)，其他組每只每天飼喂等量PBS，病毒組、BI組和AI組4d時每只小鼠飼喂毒力為10-6.28TCID50/mL輪狀病毒50μL，AI組在4d時每天灌胃50μL益生菌活菌液(106cfu/mL)。
　　1.食淀粉乳桿菌體內(nèi)對RV感染小鼠乳鼠的相關(guān)效應(yīng):感染RV乳鼠的體重增長率升降、糞樣病毒量多少和空腸黏膜組織學變化。
　　(1)體重增長率測定結(jié)果顯示:飼喂1 d～4d時各組體重增長率差異不顯著(p＞

7、0.05);飼喂4d～11d時正常組體重增長率顯著高于其他組別(p＜0.05);攻毒前后飼喂食淀粉乳桿菌，乳鼠體重增長率仍會出現(xiàn)一定程度的降低;BI組及AI組體重增長率顯著高于病毒組(p＜0.05)，BI組和AI組體重增長率差異不顯著(p＞0.05)。
　　(2)糞樣病毒量測定結(jié)果顯示:感染后2d、3d、4d、5d及7d時BI組RV含量均顯著低于病毒組(p＜0.05);AI組在感染后4d時RV含量顯著低于病毒組(p＜0.05)，其

8、他時間點差異不顯著。
　　(3)空腸黏膜組織學變化結(jié)果顯示:病毒組小腸上皮細胞出現(xiàn)輕微空泡變性，小腸絨毛內(nèi)部組織缺失較為嚴重，絨毛上皮細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，BI組及AI相對于病毒組，相關(guān)癥狀明顯減輕;BI組空腸絨毛長度在攻毒后1d和3d時顯著高于病毒組(p＜0.05)，和正常組差異不顯著(p＞0.05); AI組空腸絨毛長度大于病毒組，但差異不顯著(p＞0.05);攻毒后5d、7d時各組絨毛長度差異不顯著(p＞0.05)。

9、　　2.食淀粉乳桿菌對乳鼠空腸神經(jīng)節(jié)苷脂GM3影響實驗分為兩個方面:乳鼠空腸組織GM3定量ELISA檢測和乳鼠空腸組織GM3合成酶mRNA檢測。
　　(1)乳鼠空腸組織GM3定量ELISA檢測結(jié)果顯示，攻毒前:2d～4d時BI組及正常組差異不顯著(P＞0.05)，攻毒后:5d、9d及11d時BI組神經(jīng)節(jié)苷酯GM3含量顯著高于正常組及病毒組(P＜0.05);9d時病毒組神經(jīng)節(jié)苷酯GM3含量顯著高于正常組(P＜0.05); AI在5d

10、和11d時顯著高于病毒組(p＜0.05)，AI組在9d和11d時顯著低于BI組。
　　(2)乳鼠空腸組織GM3合成酶MusSt3gal5 mRNA結(jié)果顯示:攻毒前，BI組與正常組在2d、3d、4d時均差異不顯著(p＞0.05)，攻毒后，5d、9d時病毒組水平顯著低于正常組(p＜0.05);7d、9d及11d時BI組水平顯著低于病毒組(p＜0.05);5d、7d時AI組水平略低于病毒組(p＞0.05)。
　　(3)乳鼠空腸組織

11、GM3合成酶MusUGCG mRNA結(jié)果顯示:攻毒前，3d時BI組與正常組差異不顯著(p＞0.05)，攻毒后:7d、9d時病毒組水平均顯著低于正常組(p＜0.05);7d、9d、10d時BI組水平顯著低于正常組及病毒組(p＜0.05)，11d時AI組水平顯著低于病毒組(p＜0.05)。
　　綜上所述連續(xù)25代培養(yǎng)以及與4株屎腸球菌共培養(yǎng)后，該株食淀粉乳桿菌其抗RV能力仍然保持相對的穩(wěn)定性。該株食淀粉乳桿菌接種RV感染前后的乳鼠，其