應(yīng)用EGS基因沉默技術(shù)研究人巨細(xì)胞病毒臨床病毒株UL148基因功能.pdf

1、目的：
　　 研究外部引導(dǎo)序列（External Guide Sequences，EGS）對人巨細(xì)胞病毒（Human Cytomegalovirus，HCMV）臨床病毒株UL148基因表達(dá)的抑制作用，為探討UL148基因功能奠定基礎(chǔ)，為抗HCMV治療尋找新的治療途徑。
　　 方法：
　　 細(xì)胞外實驗：1.根據(jù)靶基因UL148序列特征設(shè)計并合成DNA性質(zhì)EGS；2.從HCMV臨床病毒株基因組中擴增UL148基因，克

2、隆入pGEM-T-EASY質(zhì)粒，PCR擴增UL148小片段，制備底物轉(zhuǎn)錄模板，參入32P-UTP后體外轉(zhuǎn)錄；3.從大腸桿菌DH5α基因組擴增M1RNA基因，將其克隆入pUC18質(zhì)粒，線性化后，體外合成M1RNA；4.將底物UL148 RNA、EGS、M1RNA混合于切割反應(yīng)液，37℃反應(yīng)1h，以聚丙烯酰胺凝膠分離產(chǎn)物，應(yīng)用Typhoons掃描儀分析切割結(jié)果。
　　 細(xì)胞內(nèi)實驗：將UL148基因克隆入pEGFP-N1質(zhì)粒，重組質(zhì)粒

3、轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，同時以pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞作為陰性對照，均以1mg/mL G418篩選4周。選取細(xì)胞外實驗證實有切割作用的EGS4，分別以50nM、100nM、200nM、400nM終濃度轉(zhuǎn)染G418篩選后的細(xì)胞。應(yīng)用熒光顯微鏡觀察上述細(xì)胞熒光量的變化；應(yīng)用熒光定量PCR進行絕對定量，分析EGS4對UL148表達(dá)量的沉默效果。
　　 結(jié)果：
　　 細(xì)胞外實驗：1.共設(shè)計5條EGS；2.成功構(gòu)建pT148

4、重組質(zhì)粒，PCR后擴增獲得UL148小片段轉(zhuǎn)錄模板，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得32P標(biāo)記的UL148小片段RNA；3.成功構(gòu)建pUC-M1重組質(zhì)粒，線性化后，體外轉(zhuǎn)錄合成M1RNA；4.在細(xì)胞外進行切割實驗，篩選出多條具有特異性切割UL148 RNA的EGS。
　　 細(xì)胞內(nèi)實驗：成功構(gòu)建p148-EGFP重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒p148-EGFP及pEGFP-N1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后，成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)UL148基因的HeLa

5、細(xì)胞系（UL148-HeLa）和穩(wěn)定表達(dá)EGFP的HeLa細(xì)胞系（EGFP-HeLa）。熒光顯微鏡觀察50nM、100nM、200nM、400nM的EGS4作用后，UL148-HeLa細(xì)胞的熒光量明顯減少，而EGFP-HeLa細(xì)胞熒光量無明顯改變。熒光定量PCR分析顯示50nM、100nM、200nM、400nM EGS4對UL148的抑制效率分別為74.9％(P<0.05)、78.6％(P<0.05)、81.1％(P<0.05)、87

6、.0％(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.經(jīng)細(xì)胞外實驗篩選出2條具有特異性切割UL148 RNA作用的EGS，分別為EGS1和EGS4；
　　 2.在細(xì)胞內(nèi)EGS4能有效沉默HCMV UL148基因的表達(dá)，并隨濃度的增加，沉默效果逐漸明顯；
　　 3.細(xì)胞外EGS切割實驗系統(tǒng)可作為細(xì)胞內(nèi)切割實驗前的一種有效篩選途徑；
　　 4.經(jīng)細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)切割實驗篩選出的有效EGS,可用于研究UL14