烙鐵頭蛇毒纖溶組分FⅥaa的分離純化、生化特征及生物活性研究.pdf

1、血栓性疾病因其較高的發(fā)病率、致殘率和死亡率，嚴(yán)重危害人類健康。臨床上亟需安全有效、特異性強(qiáng)、無出血副作用、價(jià)格合理等特點(diǎn)的溶栓藥物。蛇毒纖溶酶可以直接降解纖維蛋白，不依賴血纖溶酶原的激活，出血副作用小，已有制劑用于臨床。烙鐵頭蛇毒液富含血液循環(huán)毒素，尤其是纖維蛋白(原)溶解組分，本課題致力于從烙鐵頭蛇毒中分離出一種新的高效低毒的纖溶組分。烙鐵頭蛇粗毒經(jīng)過三步層析首次得到了一個(gè)分子量為23301Da的單鏈金屬蛋白酶FⅥaa，該組分能高效水

2、解纖維蛋白原的Aα鏈及Bβ鏈；能直接降解纖維蛋白；最小出血?jiǎng)┝繛?.08mg。同本實(shí)驗(yàn)室已成功提純的五步蛇毒纖溶組分FⅡa比較，F(xiàn)Ⅵaa降解纖維蛋白的活性更強(qiáng)，無出血毒性作用。本實(shí)驗(yàn)詳細(xì)介紹了烙鐵頭蛇毒組分FⅥaa的分離提純過程及部分生化、生物活性研究。
　　 方法：
　　 1.通過CM Sephadex C-50陽離子交換層析，DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析和Sephadex G-50

3、fine凝膠過濾層析三步從湖南產(chǎn)烙鐵頭蛇毒中分離純化目的組分FⅥaa。
　　 2.SDS-PAGE鑒定純度。
　　 3.質(zhì)譜4000 Q TRAP測(cè)定分子量。
　　 4.等電聚焦電泳測(cè)定等點(diǎn)電。
　　 5.采用偶氮酪蛋白水解法測(cè)定FⅥaa對(duì)蛋白底物的水解活性。
　　 6.采用纖維蛋白平板法測(cè)定FⅥaa對(duì)牛纖維蛋白的降解活性。
　　 7.采用普通平板和加熱平板比對(duì)的方法，了解FⅥaa與UK降

4、解纖維蛋白原理的異同。
　　 8.采用SDS-PAGE的方法觀察FⅥaa對(duì)牛纖維蛋白(原)的降解方式。
　　 9.偶氮酪蛋白法測(cè)定不同溫度、不同pH、不同濃度金屬離子和抑制劑對(duì)FⅥaa酶活性的影響。
　　 10.按照Kondo的方法，小鼠背部皮下注射不同濃度的FⅥaa，分析其出血毒性。
　　 結(jié)果：
　　 1.粗毒經(jīng)CM Sephadex C-50陽離子交換層析得到7個(gè)蛋白峰，其中第4峰(FⅣ)和

5、第6峰(FⅥ)具有較強(qiáng)的纖溶活性。FⅥ再經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析得2個(gè)蛋白峰，其中第1峰有纖溶活性，將其再過Sephadex G-50fine凝膠過濾層析得1個(gè)蛋白峰，即為目的組分。
　　 2.SDS-PAGE達(dá)到電泳純，結(jié)果顯示為一單鏈蛋白質(zhì)，質(zhì)譜測(cè)定精確分子量為23301.0Da，等電點(diǎn)主帶9.09。
　　 3.FⅥaa具有蛋白水解活性，可水解纖維蛋白原，優(yōu)先降解Aα鏈，呈時(shí)效

6、、量效關(guān)系；可直接降解纖維蛋白，不依賴于纖溶酶原的激活。
　　 4.FⅥaa為金屬蛋白酶，EDTA和DTT可顯著抑制其活性，PMSF和抑肽酶對(duì)活性幾乎無影響；Mg2+、C2++可增強(qiáng)FⅥaa的酶活性，而Cu2+、Zn2+、Co2+可抑制其活性。酶的適宜pH為8.0-11.0，適宜溫度為30-50℃。
　　 5.FⅥaa的最小出血?jiǎng)┝繛?.08mg。
　　 小結(jié)：
　　 1.通過CM Sephadex C-

7、50陽離子交換層析，DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析和Sephadex G-50 fine凝膠過濾層析三步從湖南產(chǎn)烙鐵頭蛇毒中分離純化目的組分——FⅥaa，回收率為0.78％。
　　 2.FⅥaa為單鏈金屬蛋白酶，分子量為23301.0kDa，等電點(diǎn)9.09左右。
　　 3.FⅥaa能水解纖維蛋白和纖維蛋白原，作用呈量效、時(shí)效關(guān)系，優(yōu)先降解α鏈。蛋白水解作用的適宜pH為8.0-11.0，適宜