江浙短尾蝮蛇毒解離素的分離純化及其生物活性.pdf

1、1.短尾蝮蛇毒解離素的分離純化及理化性質(zhì)測定應用Superdex 75和Sephadex G-25凝膠過濾色譜、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換色譜和Lichrospher C18反相色譜從短尾蝮蛇毒中純化得一個解離素純品，暫定名為GbvⅣ4。GbvⅣ4在SDS-PAGE(Tris-Tricine系統(tǒng))凝膠電泳中，呈單一蛋白條帶，質(zhì)譜法測定其相對分子質(zhì)量為7442Da，采用聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳測定其等電點約為6

2、.3。自動電位滴定法測定磷脂酶A2活力和Rick方法測定蛋白酶活力，結(jié)果均為0。氨基酸序列測定發(fā)現(xiàn)它由70個氨基酸組成，含有RGD三肽活性中心，6對二硫鍵，符合中鏈解離素特征。通過Genbank檢索，未發(fā)現(xiàn)與GbvⅣ4序列完全一致的氨基酸序列，是一種新的解離素蛋白。 2.GbvⅣ4對血小板聚集的影響采用經(jīng)典的Born法，發(fā)現(xiàn)GbvⅣ4在體外可抑制多種聚集劑誘導的血小板聚集，且該作用呈明顯的量效關系，GbvⅣ4對ADP、凝血酶誘導

3、的血小板聚集的EC50分別為0.298μg/ml和0.577μg/ml。 3.GbvⅣ4對人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV304生長的影響以SRB法觀察GbvⅣ4對人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV304生長的抑制作用，測定其IC50，結(jié)果GbvⅣ4使細胞突起回縮，細胞變圓，細胞浮起不再貼壁且聚集成簇，失去正常的鋪路石狀。GbvⅣ4呈劑量依賴性的抑制ECV304的生長，其作用24h的IC50為25.42μg/ml。 4.GbvⅣ4對雞胚尿

4、囊膜(Chick Chorioallantoic membrane,CAM)新生血管生成的影響選用雞胚尿囊膜模型觀察GbvⅣ4對雞胚尿囊膜血管生成的抑制作用，采用測量區(qū)血管面積與測量區(qū)面積的比值(VA/CAM)評價抑制程度。結(jié)果顯示的GbvⅣ4 3.098和11.79μg處理后可見雞胚CAM血管生成減少，分布稀疏，分支減少，但形態(tài)基本正常，呈樹狀分布，與NS組相比VA/CAM顯著減少(P<0.01)。 5.GbvⅣ4對黑色素瘤B

5、16細胞體外粘附能力的影響細胞-基質(zhì)粘附實驗觀察GbvⅣ4對B16細胞粘附能力的影響。GbvⅣ4使細胞在給藥后4h細胞突起回縮變圓，且聚集成團簇狀。采用MTT法，發(fā)現(xiàn)GbvⅣ4可抑制腫瘤細胞與纖維連接蛋白的粘附作用，抑制作用呈濃度依賴性，在終濃度16μg/ml時抑制率為59.34％。 6.GbvⅣ4對黑色素瘤B16細胞體外遷移能力的影響采用劃痕實驗檢測B16細胞體外遷移能力。在劃痕后48h，對照組的細胞在劃痕處已經(jīng)基本長滿，而G

6、bvⅣ4組的無細胞區(qū)仍較明顯。 7.GbvⅣ4對黑色素瘤B16和B16-F10細胞體外侵襲的影響應用Transwell小室重建基底膜侵襲實驗觀察GbvⅣ4對B16和B16-F10細胞侵襲能力的影響，藥物與細胞作用48h后，發(fā)現(xiàn)GbvⅣ4對B16和B16-F10細胞穿越基底膜的能力顯著降低，穿過基底膜的細胞數(shù)量與GbvⅣ4的濃度成反比. 8.GbvⅣ4對黑色素瘤B16-F10小鼠實驗性肺轉(zhuǎn)移模型的影響采用裸BALB/c小鼠

7、黑色素瘤B16-F10實驗轉(zhuǎn)移模型觀察解離素對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響，解離素腹腔注射明顯減少接種黑色素瘤B16-F10細胞小鼠的肺重和肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量，解離素(50、100μg/kg×14d)和環(huán)磷酰胺(50mg/kg×2 d)對B16黑色素瘤細胞肺轉(zhuǎn)移的抑制率分別為67.8％、82.8％和48.1％。 結(jié)論：從江浙短尾蝮蛇毒中分離得到一個解離素純品GbvⅣ4，由70個氨基酸組成，含有RGD三肽活性中心，分子量為7442Da，等電點6.3。