過表達ICAM-1對間充質干細胞生物學特性影響及自身免疫性甲狀腺炎動物模型的建立.pdf

1、目的:
　　 1.構建重組逆轉錄病毒載體MIGR1-ICAM-1，探討細胞間粘附分子1(Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)基因轉染對小鼠間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)生物學特性的影響。為進一步研究ICAM-1是否影響MSCs對自身免疫性甲狀腺炎(Autoimmune Thyroiditis，AIT)體內治療效果提供實驗基礎。

2、　　 2.利用外源性甲狀腺球蛋白免疫C57BL/6小鼠建立AIT的動物模型——實驗性自身免疫性甲狀腺炎(Experimental Autoimmune Thyroiditis，EAT)，為下一步開展大規(guī)模體內實驗提供穩(wěn)定可靠的動物模型。
　　 方法:
　　 1.通過RT-PCR方法擴增獲得小鼠脾細胞ICAM-1基因全長DNA，將其克隆至中間載體pMD19-T，行雙酶切及DNA測序鑒定后，將ICAM-1基因連接至逆轉錄病

3、毒載體MIGR1上，對重組載體MIGR1-ICAM-1進行雙酶切、RT-PCR及DNA測序分析。
　　 2.將獲得的重組逆轉錄病毒質粒MIGR1-ICAM-1及空質粒MIGR1均加入包裝質粒ECOS后分別轉染人胚腎細胞(T293細胞)，將獲得攜帶ICAM-1基因的逆轉錄病毒MIGR1-ICAM-1及空載體逆轉錄病毒MIGR1，分別感染C3H10T1/2細胞，熒光倒置顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達，real-time PCR和流式細胞

4、術檢測ICAM-1在基因水平和蛋白水平的表達。同時檢測三種細胞的形態(tài)、表型、生長特點及成脂成骨分化等一般生物學特性;并通過淋巴母細胞轉化實驗(Lymphocyte transformation test，LTT)及混合淋巴細胞反應實驗(Mixed lymphocyte reaction，MLR)檢測三種細胞的免疫學特性。
　　 3.建立EAT動物模型，將5周齡雌性C57BL/6小鼠于第0d和第14d用豬甲狀腺免疫球蛋白(Porc

5、ine Thyroglobuli，PTg)及弗氏佐劑(Freund's adjuvant，F(xiàn)A)進行兩次免疫;于實驗第28d眼球取血，測血清甲狀腺球蛋白抗體(Thyroglobulin Antibody，TgAb)、甲狀腺過氧化物酶抗體(AntithyroidPeroxidase Antibodies，TPOAb)、甲狀腺微粒體抗體(Thyroid microsomalAutoantibody，TMAb)水平，并分離甲狀腺組織行HE染色

6、及組織病分析。
　　 結果:
　　 1.對重組載體MIGR1-ICAM-1雙酶切和RT-PCR電泳均顯示獲得1700bpICAM-1目的基因片段;DNA測序結果顯示與基因文庫中的小鼠ICAM-1基因序列完全相同，且插入方向正確，從而證實成功構建重組逆轉錄病毒載體MIGR1-ICAM-1。
　　 2.逆轉錄病毒感染C3H10T1/2細胞后，熒光倒置顯微鏡下可見絕大部分細胞表達綠色熒光;real-time PCR和流

7、式細胞術分別在轉錄水平(相對表達量1625.82±119.42)和蛋白水平（表達量90.3％）證實ICAM-1在C3H10T1/2細胞中均有高表達，從而證明獲得穩(wěn)定過表達ICAM-1的間充質干細胞系C3H10T1/2(C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC)。
　　 3.進一步對過表達ICAM-1的C3H10T1/2細胞的生長特性、誘導分化能力及免疫學功能進行研究，結果表明，過表達ICAM-1可使C3H10T1/2

8、細胞(29.18±2.47)％處于S期，且倍增時間縮短。在成脂誘導分化中，C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC獲得脂肪細胞數(shù)顯著降低(12.18±3.83/孔)，且脂滴變小;real-time PCR檢測成脂分化關鍵轉錄因子C/EBPα和PPARγ的表達均顯著下調;同樣，在成骨分化中，過表達ICAM-1可使C3H10T1/2成骨分化的堿性磷酸酶活性及礦化骨結節(jié)形成能力顯著下降，關鍵轉錄因子Runx2和Osteocalci

9、n在mRNA表達水平亦顯著降低，提示過表達ICAM-1可顯著降低MSCs的成脂和成骨分化能力。
　　 4.利用淋巴母細胞轉化實驗(Lymphocyte transformation test，LTT)和混合淋巴細胞反應(Mixed lymphocyte reaction，MLR)對過表達ICAM-1的MSCs進行免疫功能檢測，結果顯示，在LTT體系中，當MSCs∶T細胞分別為1∶40和1∶5時， C3H10T1/2-MIGR1-

10、ICAM-1/MSC與對照組 C3H10T1/2-MIGR1/MSC的cpm值分別為(1955.25±292.60)、(2285.33±303.67);(812.00±21.17)、(1335.00±209.18);同樣，在MSCs作為滋養(yǎng)層的MLR反應體系中，當刺激細胞∶效應細胞為1∶1和1∶25時，C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC與對照組C3H10T1/2-MIGR1/MSC的cpm值分別為(1598.50±11

11、0.74)、(1859.00±111.25);(1147.50±55.91)、(1493.00±98.33)。提示過表達ICAM-1的MSCs具有顯著抑制T細胞增殖的能力，且具有劑量依賴性，隨著MSCs數(shù)量的增加，其抑制能力逐漸增強。
　　 5.C57BL/6小鼠經外源性甲狀腺球蛋白皮下免疫誘導后，結果顯示，模型組小鼠血清中TPOAb、TMAb、TgAb的水平[(60.36±4.53)、(67.47±6.25)、(65.67±5

12、.35)]均顯著高于對照組小鼠[(21.45±4.66)、(7.68±2.76)、(7.59±2.23)];甲狀腺病理顯示濾泡間質存在淋巴細胞浸潤情況，具有典型EAT特征。
　　 結論:
　　 1.本研究通過構建ICAM-1的重組逆轉錄病毒載體MIGR1-ICAM-1，成功獲得穩(wěn)定過表達ICAM-1的間充質干細胞系C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC。
　　 2.對過表達ICAM-1的MSCs生物