瘤胃固氮菌與三種來源兼性纖維菌混合對體外發(fā)酵影響.pdf

1、反芻動物瘤胃能很高效的利用飼料中的粗飼料，并作為其主要的能量來源，主要因為瘤胃內(nèi)有大量分解纖維素的纖維素分解菌。瘤胃纖維素菌大多數(shù)是嚴格厭氧菌，然而也存在兼性厭氧纖維素菌。我們實驗室前期通過體外培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，將從奶牛瘤胃內(nèi)分離的的兼性厭氧纖維素菌和固氮菌混合添加時，能夠調(diào)節(jié)瘤胃的內(nèi)環(huán)境、并提高飼料的降解率。然而，兼性厭氧纖維菌是瘤胃內(nèi)固有的，還是從外界進入的，目前還很少有人研究。由于瘤胃對于飼料是個“開放”的環(huán)境，一些兼性厭氧纖維菌和固

2、氮菌可能隨飼料進入瘤胃。我們推測在采食后一定時間內(nèi)的有氧環(huán)境中，兼性厭氧菌可能對發(fā)酵起到了一定作用。本試驗選取一種從瘤胃液中分離的兼性厭氧固氮菌和從瘤胃液、土壤、飼料三種來源分離的兼性厭氧纖維素菌混合，探討其對體外發(fā)酵的影響。
　　試驗1:菌種的復活與計數(shù)
　　試驗選用的菌株由我所在實驗室前期分離自飼料、瘤胃液、土壤，包括兼性厭氧纖維素菌和固氮菌。菌液與30％甘油以1∶1比例混合保存在-20℃的冰箱中。每種來源選取高纖維素酶

3、活性和低纖維素酶活性各一株，并使不同來源菌具有相近的纖維素酶活性。選定的纖維素菌株分別為:從土壤中分離的T1(2.576U·mL-1)和T4(0.351U·mL-1)、從飼料分離的S1(2.824U·mL-1)和S4（0.345U·mL-1）、以及從瘤胃液分離的L6(3.199U·mL-1)和L4(0.593U·mL-1)。另外，選取一株從瘤胃液分離的兼性厭氧固氮菌L5（17.637U·mL-1）。將所選取的菌株從冰箱中取出、解凍，然后

4、進行復活、增殖培養(yǎng)。
　　試驗2:混合菌對體外發(fā)酵的影響
　　將試驗1培養(yǎng)好的6個兼性厭氧纖維菌和兼性厭氧固氮菌混合（比例為4∶1），形成6種混合菌，分別記為L4，S1，T4，L6，S4和T1，用其進行體外發(fā)酵試驗。試驗在體外培養(yǎng)裝置上完成，裝置主要由HZS-H型恒溫水浴搖床和100 mL的注射器組成。本試驗包括6個試驗組和1個對照組，每組7個重復（即7個注射器）。向每個注射器內(nèi)裝入0.200 g(精確到0.001 g)發(fā)酵

5、底物（精∶粗=45∶55），加入1 mL的混合菌液（添加菌量均為1.2×109 CFU/mL，對照組內(nèi)加入1 ml滅活的混合菌液）和30 mL培養(yǎng)液，放入體外發(fā)酵培養(yǎng)裝置中進行發(fā)酵試驗。當發(fā)酵進行至2、4、8、12、24小時，記錄注射器的讀數(shù)（即產(chǎn)氣量）。培養(yǎng)24 h發(fā)酵結(jié)束，將注射器內(nèi)全部培養(yǎng)物取出，并立即用酸度計測定pH，然后將培養(yǎng)物以3500 r/min離心15 min，上清液分別裝入不同的離心管中，放置-20℃冰箱冷凍保存，待測

6、氨態(tài)氮(NH3-N)、菌體蛋白(MCP)、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和濾紙酶活性、羧甲基纖維素鈉(CMC)酶活性、β-葡萄糖苷酶活性;另取上清液保存在-80℃冰箱，用于三種纖維素菌測定。沉淀用于測定干物質(zhì)降解率(DMD)。結(jié)果表明:加入混合菌的試驗組與對照組相比，加入混合菌的試驗組與對照組相比，各試驗組產(chǎn)氣量顯著升高(P＜0.05);各試驗組的DMD與對照組相比均有顯著提高（P＜0.05），其中T1試驗組的DMD最高，而T4試驗組的DMD最

7、低;各試驗組對pH的影響顯著提高(P＜0.05)，其中L4試驗組的pH最高，T1試驗組的pH最低;各試驗組與對照組相比對NH3-N的濃度的影響有顯著的提高(P＜0.05)，其中T1試驗組最高，L4、L6、 T4試驗組相對較高;各試驗組的MCP濃度與對照組相比有顯著的提高(P＜0.05);各試驗組對VFA濃度的影響有顯著提高（P＜0.05），且低于對照組，L4、試驗組的VFA濃度最高，T1試驗組的VFA濃度最低;各試驗組對纖維素酶活的影響

8、顯著均高于對照組，試驗組中L4的濾紙酶活性最高，S1的濾紙酶酶活性最低、L4試驗組的CMC酶活性最高，β-葡萄糖苷酶活基本相近;加入混合菌后試驗組與對照組相比對白色瘤胃球菌的菌群數(shù)量的影響顯著變少(P＜0.05)，然而對黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌卻有明顯的增加（P＜0.05）。低纖維素酶活與高纖維素相比對產(chǎn)氣量、pH、VFA、NH3-N、均有顯著影響。然而對濾紙酶活性、CMC酶活性、β-葡萄糖苷酶活性、DMD、及MCP等沒有顯著影響