甘蔗內(nèi)生固氮菌與甘蔗互作的研究.pdf

1、甘蔗是重要的糖料和能源作物,廣西是世界第二大產(chǎn)糖省(區(qū)),甘蔗栽培面積占全國的60％以上,氮肥投入約9.3億元/年。大量的氮肥投入增加了甘蔗生產(chǎn)的成本,降低了甘蔗生產(chǎn)的效益,同時對生態(tài)環(huán)境造成嚴重的負面影響,挖掘甘蔗本身的固氮潛能可能足解決這一問題的有效途徑。本研究通過對固氮菌的分離、鑒定、固氮特性和在甘蔗體內(nèi)的生長繁殖動態(tài),以及入侵甘蔗后對固氮、氮代謝、激素合成等生理指標和對株高、分蘗等外觀農(nóng)藝性狀影響的研究,探討甘蔗內(nèi)生固氮菌與甘蔗

2、的相互作用效應(yīng),得到主要結(jié)果如下:
　　 1.從甘蔗品種桂糖28號(GT28)根系分離到3個固氮菌株,通過形態(tài)學(xué)、生理生化和16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析確定所獲得的菌株分別屬植生克雷伯氏菌(Klebsiellaplantica)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)和成團泛菌(Pantoeaagglomerans),分別命名為KlebsiellaplanticaL03、KlebsiellaoxytocaL09

3、和PantoeaagglomeransA01。固氮特性研究表明,3個菌株的固氮能力對氧、氮、溫度敏感,在適宜的培養(yǎng)條件下,A01、L03和L09的最高固氮百分率分別達到3.3％Ndfa、29.3％Ndfa和26.0％Ndfa。L03在低氮培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)時同氮活性穩(wěn)定,在高氮培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)時固氮作用受到抑制,并隨著氮含量的增加抑制作用越來越明顯。
　　 2.利用轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)能將pPAJ1819質(zhì)粒中的gfp基因轉(zhuǎn)座到L03基

4、因組中并成功表達,獲得具有熒光活性的突變L03菌株(MutationL03,ML03)。ML03的菌落在紫外光下發(fā)出肉眼可見的強綠色熒光,在熒光顯微鏡下能觀察到邊緣清晰的菌落形態(tài);ML03能定殖于ROC22組培苗的根、莖、葉以及葉鞘組織的胞內(nèi)和胞間,以定殖胞內(nèi)為主。在接種ML031d后,在根毛區(qū)觀察到ML03從根冠及根毛側(cè)面入侵植株;2d后在根內(nèi)定殖;4d后大量定殖于根中柱外圍,部分進入根中柱;7d后在莖內(nèi)部的薄壁組織有大量ML03生長

5、、繁殖;8d后ML03大量入侵輸導(dǎo)組織和葉片葉肉細胞,同時大量定殖于葉鞘組織的胞內(nèi)和胞間。
　　 3.利用15N同位素稀釋法,研究接種固氮菌對甘蔗品種B8和ROC22的生物固氮的影響,結(jié)果表明:B8和ROC22的根、莖、葉都可發(fā)生固氮作用,接種L03能提高ROC22和B8的固氮百分率,兩個甘蔗品種的固氮百分率和固氮量都以10d最低,60d最高。B8在不同時期的固氮百分率和固氮量顯著高于ROC22的。ROC22和B8的根系在10d

6、、30d和60d的固氮百分率之間的差異極顯著,ROC22葉片中的固氮百分率在測定范圍內(nèi)隨時間推移均勻上升,而B8不同部位的固氮活性差異很大。ROC22和B8的平均固氮百分率都表現(xiàn)為葉>莖>根。除B8莖30d時固氮能力最強外,兩個甘蔗品種不同器官都以60d時的固氮能力最強。說明L03的固氮作用在不同品種、同一品種的不同生長時期甚至不同器官中都有很大的差異。
　　 4.接種L03能提高ROC22和B8不同部位的含氮量,對ROC22根

7、和莖的作用效果都在60d時達到顯著水平,對葉片含氮量的作用時期從10d開始達到顯著水平,在30d和60d時達到極顯著水平。B8根和葉的含氮量在接種后30d與對照有顯著差異,60d時差異達到極顯著水平;B8莖在接種后10d含氮量就顯著提高,30d和60d時差異達到極顯著水平。這說明固氮菌株L03對ROC22和B8根、莖和葉中的氮素積累都有促進作用,其中對ROC22葉和B8莖的促進作用最大。推斷同一固氮菌對不同甘蔗品種的作用效應(yīng)不同,同一甘

8、蔗品種的不同部位固氮活性也有差異。
　　 5.固氮菌液浸種莖能明顯提高ROC22和B8的分蘗率,對GT28分蘗率影響不明顯。對株高的效應(yīng)表現(xiàn)為ROC22和GT28都以L09浸種莖處理的植株最高,B8以L03浸種莖的處理最高。固氮菌液浸種莖有可能促進或是抑制株高。相同固氮菌對不同甘蔗品種株高的影響不同,不同固氮菌對相同甘蔗品種的株高也有不同的效應(yīng)。浸種莖菌液的固氮活性高低與分蘗率和株高之間沒有明顯的相關(guān)性。
　　 6.固氮

9、菌液浸種莖能顯著提高ROC22組培苗體內(nèi)的氮代謝指標,提高硝酸還原酶活性和降低銨態(tài)氮的含量。單一固氮菌處理的谷氨酰胺合成酶活性和可溶性蛋白、可溶性糖含量與固氮活性呈正相關(guān),表現(xiàn)為L03>L09>A01。固氮活性最低的混合菌液(Mix)處理ROC22組培苗后最大幅度提高了各氮代謝指標的含量。推斷L03、L09和A01之間有拮抗作用,相互拮抗降低了Mix的固氮酶活性,但侵染到甘蔗植株后,由于不同固氮菌的作用部位不同而消除了相互拮抗的影響,使

10、得Mix對各氮代謝指標起到最明顯的提高作用。
　　 7.接種L03能提高ROC22組培苗體內(nèi)的生長素(IAA)含量、玉米素(ZR)含量和乙烯(EH)釋放量,降低赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)的含量。對ZR的作用效應(yīng)在處理后3d達到極顯著水平,對IAA和EH的作用效應(yīng)在處理后7d達到極顯著水平;對GA3和ABA的抑制作用從接種后第3d起均到極顯著水平。接種L03還明顯提高了ABA/IAA比率、EH/IAA比率及接種3d時的ZR