核酸疫苗的基因佐劑研究.pdf

1、DNA疫苗又稱核酸疫苗，作為一種新型疫苗,DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有著明顯的優(yōu)勢(shì)，如易于生產(chǎn)，穩(wěn)定性強(qiáng)，成本低廉等，并可同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，但DNA疫苗的免疫效果在不同動(dòng)物個(gè)體中差異較大，有些疫苗在小個(gè)體的動(dòng)物中免疫和保護(hù)效果較好，而在大個(gè)體動(dòng)物中效果較差，尤其是在大型動(dòng)物和人類中，影響了它的實(shí)際應(yīng)用。如何增強(qiáng)DNA疫苗的免疫反應(yīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。 我們以HBVDNA疫苗作為模型抗原，選擇結(jié)核分支桿菌的熱休克蛋白

2、65、金黃色葡萄球菌腸毒素A和人胸腺素α原基因作為HBVDNA疫苗的佐劑，進(jìn)行DNA疫苗免疫佐劑的研究。 本研究克隆了HBV的preS2S基因、結(jié)核分支桿菌的熱休克蛋白65、金黃色葡萄球菌腸毒素A和人胸腺素α原基因，構(gòu)建了三種單獨(dú)表達(dá)的佐劑質(zhì)粒：pHSP65、pmSEA、pThyα；三種融合表達(dá)的佐劑-抗原質(zhì)粒：pHSP65/HBVs2s、pmSEA/HBVs2s、pThyα/HBVs2s；以及單獨(dú)的模型抗原質(zhì)粒pHBVs2s。

3、體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或P815細(xì)胞，除外pmSEA/HBVs2s，WesternBlot均檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)，ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的HBsAg與相應(yīng)的抗HBsAg抗體能產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)，說(shuō)明表達(dá)的重組抗原具有抗原性。 DNA疫苗與其佐劑免疫小鼠。ELISA結(jié)果顯示三種佐劑均可增強(qiáng)pHBVs2s免疫小鼠抗HBs的產(chǎn)生，與單獨(dú)pHBVs2s免疫組相比，提高了抗HBs抗體滴度。激發(fā)抗HBs抗體滴度的高低順序依次是pH

4、BVs2s+pThyα、pHBVs2s+pmSEA、pHBVs2s+pHSP65、pHBVs2s。ELISPOT檢測(cè)分泌IFN-γ的脾淋巴細(xì)胞數(shù)量高低順序依次是pHBVs2s+pmSEA、pHBVs2s+pThyα、pHBVs2s+pHSP65、pHBVs2s。HBsAg特異性CTLs的殺傷活性高低順序分泌IFN-γ的脾淋巴細(xì)胞數(shù)量高低相一致。兩種融合基因組小鼠也激發(fā)了抗HBs，其抗HBs抗體滴度的高低順序依次是pThyα/HBVs2s

5、和pHSP65/HBVs2s，pmSEA/HBVs2s未能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗HBs抗體。HBsAgIgG亞類的分析發(fā)現(xiàn)：pThyα、pmSEA和pHSP65明顯提高IgG2a，促進(jìn)Th0向Th1分化。 另外，我們初步探討了佐劑和疫苗分別與混合注射、導(dǎo)入體內(nèi)的方法、免疫次數(shù)、與多肽疫苗聯(lián)合應(yīng)用等影響佐劑和疫苗的因素。發(fā)現(xiàn)佐劑和疫苗的注射部位不能距離太遠(yuǎn)，否則佐劑將不能起到“幫助”作用。在佐劑和疫苗的注射部位施加瞬時(shí)電脈沖，可以增加了質(zhì)

6、粒DNA進(jìn)入肌肉細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞的數(shù)量，提高小鼠對(duì)DNA疫苗的反應(yīng)性。DNA疫苗和多肽疫苗聯(lián)合應(yīng)用，可以獲得最佳效果。增加DNA疫苗免疫次數(shù)，有助于提高動(dòng)物的反應(yīng)性。 由于建立DNA疫苗和基因佐劑的時(shí)間尚短，其作用機(jī)制尚不十分清楚。本研究發(fā)現(xiàn)胸腺素α原不僅增強(qiáng)HBVDNA疫苗的細(xì)胞免疫，提高抗HBs抗體滴度，而且以融合或非融合形式均能增強(qiáng)小鼠對(duì)HBVDNA疫苗的免疫應(yīng)答，因此，胸腺素α原有望成為良好的候選基因佐劑。其為DNA疫