不同分子佐劑對ALV-J ENV基因核酸疫苗免疫效果研究.pdf

1、J亞群白血病病毒(Avian Leukosis virus subgroup J，ALV-J)是1988年首次從大不列顛白羽肉雞中分離得到的一種禽白血病病毒新的亞群,主要引發(fā)雞的髓細(xì)胞組織增生和腎瘤。ALV-J與A、B亞群一樣，屬于外源性禽白血病病毒，在雞體內(nèi)既能垂直傳播也能水平傳播，且J亞群水平傳播的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于A、B亞群病毒，該病已迅速蔓延到許多國家，使養(yǎng)雞業(yè)面臨一個嚴(yán)重問題。
　　 目前ALV-J的防治沒有商品化的疫苗，主

2、要依靠凈化種雞群的辦法來控制和清除ALV-J，由于養(yǎng)殖環(huán)境已被污染，完全實(shí)施凈化是艱難和不可能完全實(shí)現(xiàn)的。許多科學(xué)家正在積極研制ALV-J疫苗，但是研究表明在滅活A(yù)LV-J病毒的同時會破壞其誘導(dǎo)抗體的能力，而由于ALV-J本身復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)，理想的弱毒疫苗的獲得也沒有成功。所以，研制新型有效的ALV-J疫苗勢在必行。
　　 核酸疫苗是20世紀(jì)90年代后發(fā)展起來的新型疫苗之一，具有制備方便、免疫力持久、副作用少等優(yōu)點(diǎn)，但是該疫苗存

3、在產(chǎn)生抗體慢，水平低的缺點(diǎn)，需要有效的佐劑進(jìn)行克服。近年來，越來越多的生物活性小分子被證明可以增強(qiáng)疫苗的免疫效果，選擇分子佐劑來增強(qiáng)核酸疫苗的免疫效果的研究也越來越多，不斷有各種新型的分子佐劑出現(xiàn)，本研究從中選擇IgG Fc片段、C3d片段、三肽囊素(Bursin)、胸腺五肽(TP-5)，其中IgG融合蛋白能夠增強(qiáng)抗原蛋白的免疫原性;C3d片段作為新型分子佐劑的研究已有很多;三肽囊素、胸腺五肽作為機(jī)體生物活性小分子可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，

4、目前被廣泛應(yīng)用到重度感染、肝炎、腫瘤的免疫治療中。
　　 本研究通過基因合成或PCR、RT-PCR、重疊PCR方法克隆分子佐劑基因，構(gòu)建含有不同分子佐劑的ALV-J的pcDNA3.1重組質(zhì)粒.并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，經(jīng)間接免疫熒光進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測.用重組質(zhì)粒分別免疫小鼠，通過ELISA試劑盒檢測小鼠體內(nèi)抗ALV特異性抗體、IL-4和IFN-γ的水平，檢測重組質(zhì)粒的免疫效果。
　　 成功克隆豬C3d及雞IgG Fc片段基

5、因，并將不同分子佐劑(C3d、Fc、BS、TP)與ALV-J ENV連接，然后克隆到pcDNA3.1真核表達(dá)載體中，經(jīng)過酶切鑒定證明成功構(gòu)建含有不同分子佐劑的(C3d、Fc、BS、TP)的ALV-J ENV重組質(zhì)粒。
　　 大量提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至HEK-293T細(xì)胞后，48h后經(jīng)間接免疫熒光證明重組質(zhì)粒能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。將質(zhì)粒純化定量，分別免疫小鼠，通過ELISA試劑盒檢測小鼠體內(nèi)ALV-JENV基因特異性抗體、IL-4及IFN-γ

6、的水平?？贵w檢測結(jié)果顯示在免疫第三次后達(dá)到最高，實(shí)驗(yàn)組均比對照組高且差異顯著，其中pcDNA3.1-Fc-ENV組抗體效價最高與空白對照組及pcDNA3.1-ENV組差異顯著。IL-4及IFN-γ檢測結(jié)果顯示IL-4及IFN-γ含量隨免疫次數(shù)的增加而逐步增加，在第三次免疫（第五周）后到達(dá)高峰，然后逐漸下降，實(shí)驗(yàn)組均高于ENV對照組且差異顯著，其中pcDNAY1-Fc-ENV和pcDNA3.1-C3d-ENV含量較高與pcDNA3.1-E