自體骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化為成肌細胞修復(fù)兔高壓電損傷的實驗研究.pdf

1、[目的]各種損傷包括高壓電損傷引起的肌肉組織缺損目前尚無理想的治療方法。組織工程修復(fù)將是未來發(fā)展的方向。本課題通過體外分離培養(yǎng)擴增兔骨髓間充質(zhì)干細胞(rabbitbonemarrowmesenchymalstemcells，rMSC)并向成肌細胞誘導(dǎo)分化，以及誘導(dǎo)分化后的成肌細胞移植修復(fù)兔高壓電損傷后的肌肉缺損，研究兔骨髓間充質(zhì)干細胞作為種子細胞，利用組織工程技術(shù)修復(fù)電損傷后肌肉缺損的可行性，為進一步利用組織工程技術(shù)完美修復(fù)電損傷提供實

2、驗依據(jù)。 [方法]本課題實驗設(shè)計包括3個部分。第一部分，兔骨髓間充質(zhì)干細胞(rMSC)的分離和體外培養(yǎng)與擴增。第二部分，體外培養(yǎng)的兔骨髓間充質(zhì)干細胞的成肌細胞誘導(dǎo)分化。第三部分，分化后的成肌細胞移植修復(fù)兔高壓電損傷。其中第一部分采用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離兔骨髓間充質(zhì)干細胞，在體外培養(yǎng)擴增，觀察兔骨髓間充質(zhì)干細胞體外增殖能力；第二部分選用5-氮雜胞苷(5-azacytidine，5-aza)為誘導(dǎo)劑，對傳代培養(yǎng)擴增后的兔骨

3、髓間質(zhì)干細胞進行誘導(dǎo)分化，觀察兔骨髓間充質(zhì)干細胞在5-aza誘導(dǎo)下的變化；第三部分，收集分化后的細胞移植于兔高壓電損傷肌肉進行性壞死動物模型，觀察修復(fù)治療效果 [結(jié)果]1.體外培養(yǎng)出兔骨髓間充質(zhì)干細胞并傳代3次體外培養(yǎng)第1天，兔骨髓MSC呈小圓形，單個核細胞，懸浮于培養(yǎng)液表層；第3天部分細胞呈梭形延展，并貼附于瓶底，可見核分裂現(xiàn)象；第5天貼壁細胞增多，并呈極性生長，可見分裂的細胞核，部分連接成片；第7天可見貼壁的細胞多數(shù)連接成片

4、，核分裂現(xiàn)象布滿視野；第9天則大部分瓶底都有貼壁MSC細胞生長，并開始呈纖維狀排列；第12天貼壁細胞長滿瓶底，呈纖維狀規(guī)則排列。體外傳代培養(yǎng)的兔MSC細胞形態(tài)學(xué)與原代細胞大致相似，生長稍快。傳代3次后的第3代細胞仍保持增殖能力。用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD34陰性CD44陽性。 2.體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞在5-aza誘導(dǎo)下向成肌細胞分化在用含有5-aza的DMEM培養(yǎng)基對兔骨髓間充質(zhì)干細胞進行體外連續(xù)誘導(dǎo)24h后，繼續(xù)培

5、養(yǎng)7天開始，骨髓間充質(zhì)干細胞出現(xiàn)長梭形肌管樣結(jié)構(gòu)，部分融合，第12天現(xiàn)出現(xiàn)成肌細胞的特征，用免疫組化檢測Desmin染色陽性。 3.誘導(dǎo)分化后的細胞移植兔高壓電損傷后的骨骼肌缺損部位時，缺損被修復(fù)。收集誘導(dǎo)分化的成肌細胞注射到兔高壓電損傷動物模型骨骼肌缺損部位，缺損的骨骼肌得以修復(fù)。 [結(jié)論]本課題研究表明密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)能在體外分離兔骨髓間充質(zhì)干細胞并在體外連續(xù)培養(yǎng)及傳代，在5-aza誘導(dǎo)下可以向成肌細胞分化，