MicroRNA-133誘導(dǎo)綿羊間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞的研究.pdf

1、已有研究證實(shí)，miR-133在肌肉發(fā)育中起到非常重要的作用。間充質(zhì)干細(xì)胞是具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞。為了探明利用miR-133誘導(dǎo)綿羊臍帶和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為成肌細(xì)胞的方法，本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將肌肉特異表達(dá)的miR-133轉(zhuǎn)染到綿羊臍帶、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，檢測(cè)其誘導(dǎo)為成肌細(xì)胞的能力。其研究結(jié)果如下：
　　1.綿羊臍帶、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
　　采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將-miR-133a2表達(dá)載體或miR-13

2、3mimics分別轉(zhuǎn)染綿羊臍帶間充質(zhì)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;
　　2.轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)與形態(tài)觀察
　　將上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)的第28d，在倒置熒光顯微鏡下細(xì)胞呈現(xiàn)梭形或紡錘形;當(dāng)細(xì)胞約達(dá)到80％匯合時(shí)，細(xì)胞由渦旋狀生長(zhǎng)變成定向有序的排列生長(zhǎng)，并且鄰近細(xì)胞間出現(xiàn)融合傾向;
　　3.轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定
　　(1)成肌細(xì)胞特異表達(dá)基因的qRT-PCR檢測(cè)采用qRT-PCR方法檢測(cè)上述細(xì)胞骨骼肌特異基因MyoD、MyoG、D

3、esmin、Tnni2、Myf5表達(dá)情況。在轉(zhuǎn)染前未檢測(cè)到MyoD和MyoG表達(dá)，轉(zhuǎn)染后可以檢測(cè)到MyoD和MyoG的表達(dá); Desmin、Tnni2、Myf5在轉(zhuǎn)染后相對(duì)表達(dá)量增加。此外，與綿羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在誘導(dǎo)后Desmin、Tnni2、Myf5相對(duì)表達(dá)量增加更多;
　　(2)成肌細(xì)胞特異表達(dá)基因的免疫熒光檢測(cè)利用MyoD、Desmin和α-actin相應(yīng)抗體對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，其結(jié)果，與

4、對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染細(xì)胞）在鏡下未檢測(cè)到相應(yīng)基因發(fā)出熒光相比，4組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，MyoD和Desmin蛋白檢測(cè)結(jié)果均呈現(xiàn)陽(yáng)性，而α-actin呈現(xiàn)陰性;
　　(3)成肌細(xì)胞特異表達(dá)基因的流式細(xì)胞檢測(cè)當(dāng)將pcDNA3.1-miR-133a2表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染綿羊臍帶和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，采用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)成肌細(xì)胞特異蛋白MyoD、Desmin和α-actin，其結(jié)果，在綿羊臍帶、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，表達(dá)MyoD的細(xì)胞量分別為12.2％和

5、29.6％，表達(dá)Desmin的細(xì)胞量分別為99.3％和99.5％，表達(dá)α-actin的細(xì)胞量分別為0.917％和9.24％;當(dāng)將miR-133mimics分別轉(zhuǎn)染綿羊臍帶和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，在這些細(xì)胞中檢測(cè)到表達(dá)MyoD的細(xì)胞量分別為99.3％和43.7％，表達(dá)Desmin的細(xì)胞量分別為99.0％和100％，表達(dá)α-actin的細(xì)胞量分別為1.07％和1.68％;
　　上述結(jié)果表明，利用miR-133成功誘導(dǎo)綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞