HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)沙眼衣原體及體外藥敏試驗(yàn)的探索.pdf

1、目的：尋找更適于沙眼衣原體生長、體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果更符合臨床療效的沙眼衣原體宿主細(xì)胞。
　　方法：試用HaCaT細(xì)胞進(jìn)行沙眼衣原體培養(yǎng)并傳代，用HaCaT細(xì)胞檢測本地區(qū)近年來泌尿生殖道沙眼衣原體對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、喹諾酮類、利福霉素在體外敏感性;與McCoy細(xì)胞中的藥敏結(jié)果相比較。
　　1、用常規(guī)沙眼衣原體培養(yǎng)的方法，將E型標(biāo)準(zhǔn)株和臨床標(biāo)本接種于HaCaT細(xì)胞，并分別用碘染、單克隆熒光抗體檢測、PCR擴(kuò)增沙眼衣原體內(nèi)源性質(zhì)

2、粒的方法檢測沙眼衣原體是否能夠感染HaCaT細(xì)胞。為探索HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)沙眼衣原體的最佳條件，用0，10、20、30、40、50μg/ml DEAE-D預(yù)處理HaCaT細(xì)胞30分鐘，接種后用0，1000、1500、2000、2451g離心1小時(shí)，計(jì)數(shù)包涵體并用SPSS17軟件進(jìn)行單因素方差分析。
　　2、檢測沙眼衣原體E型標(biāo)準(zhǔn)株和34例沙眼衣原體臨床株分別在HaCaT細(xì)胞和McCoy細(xì)胞中對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、喹諾酮類、利福霉

3、素四類10種抗生素在體外的敏感性。用SPSS17軟件進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析34例臨床株在兩種細(xì)胞中的藥敏結(jié)果是否有差異。PCR擴(kuò)增34例臨床株的omp1基因并用AluⅠ、 MspⅠ雙酶切進(jìn)行基因分型，比較不同血清型在體外藥敏結(jié)果的是否存在差異。
　　結(jié)果：
　　1、通過碘染、單克隆熒光抗體檢測、PCR擴(kuò)增沙眼衣原體內(nèi)源性質(zhì)粒鑒定HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)沙眼衣原體成功。沙眼衣原體E型標(biāo)準(zhǔn)株在HaCaT細(xì)胞中經(jīng)傳代包涵體數(shù)逐

4、漸增多，證明沙眼衣原體在HaCaT細(xì)胞中可以增殖。在現(xiàn)有條件下， DEAE-D預(yù)處理HaCaT細(xì)胞的最佳終濃度為30μg/ml，最佳離心力為2451g。
　　2、在HaCaT細(xì)胞內(nèi)沙眼衣原體E型標(biāo)準(zhǔn)株對阿奇霉素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、莫西沙星、司帕沙星的MIC值比McCoy細(xì)胞中高出一個(gè)滴度，其余5種藥物在兩種細(xì)胞中的MIC值一致。34例沙眼衣原體臨床株在McCoy細(xì)胞內(nèi)測得的MIC值(單位mg/L)為:紅霉素0.125-1，克拉霉

5、素0.004-0.016，阿奇霉素0.032-0.25，四霉素0.04-0.625，多西霉素0.016-0.5，米諾環(huán)素0.004-0.128，左氧氟沙星0.125-1，莫西沙星0.03-0.24，司帕沙星0.016-0.128，利福平0.001-0.03;HaCaT細(xì)胞測得的MIC值(單位mg/L)為:紅霉素0.125-2，克拉霉素0.004-0.064，阿奇霉素0.032-4，四霉素0.02-1.25，多西霉素0.016-1，米諾環(huán)

6、素0.008-0.512，左氧氟沙星0.25-4，莫西沙星0.03-0.96，司帕沙星0.032-1.024，利福平0.001-0.015。其中一部分菌株在HaCaT細(xì)胞中的MIC值比McCoy細(xì)胞中要高，藥敏結(jié)果判定為耐藥。在HaCaT細(xì)胞和McCoy細(xì)胞中測得的MIC值，比以往文獻(xiàn)報(bào)道的MIC值均有所升高。經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析在兩種細(xì)胞中的藥敏結(jié)果發(fā)現(xiàn):除利福平外所檢測的9種抗生素的MIC值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。34例臨床株omp

7、1基因分型結(jié)果為E型25株，D型8株，F(xiàn)型1株。大部分抗生素抗沙眼衣原體MIC值為F型最低，D型居中，E型最高。同一血清型的沙眼衣原體在HaCaT細(xì)胞和McCoy細(xì)胞中的藥敏MIC值是存在差異的。
　　結(jié)論：1首次采用HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)沙眼衣原體成功為沙眼衣原體體外培養(yǎng)提供了新的選擇，培養(yǎng)條件的優(yōu)化為進(jìn)一步研究沙眼衣原體的致病機(jī)理、免疫機(jī)制、體外藥物敏感性、耐藥機(jī)制和保護(hù)性疫苗等奠定了基礎(chǔ)。2本研究測得的臨床株對多種抗生素的MIC

8、值均較以往文獻(xiàn)報(bào)道有所升高，提示沙眼衣原體對抗菌藥的敏感性呈不同程度的下降。沙眼衣原體在體外對多種抗生素的藥敏結(jié)果在不同培養(yǎng)細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞和McCoy細(xì)胞）間存在差異:部分菌株在HaCaT細(xì)胞中測得的MIC值高于在McCoy細(xì)胞中的MIC值，藥敏結(jié)果判定為耐藥。應(yīng)用HaCaT細(xì)胞可以檢測到更多的耐藥株，這種結(jié)果更接近臨床治療高失敗率的現(xiàn)狀。HaCaT細(xì)胞進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的結(jié)果是否更符合臨床治療情況，HaCaT細(xì)胞是否更易于篩出耐藥菌株