雷帕霉素抑制膽管缺血后代償性增生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著雷帕霉素在臨床越來越廣泛的應(yīng)用,其副作用也逐漸引起人們的注意。除了可以引起血液學(xué)變化,如貧血,低白細(xì)胞血癥,低血小板血癥,高膽固醇血癥；關(guān)節(jié)痛；肢體水腫；切口愈合不良等副作用外,研究發(fā)現(xiàn),雷帕霉素能導(dǎo)致肺毒性等嚴(yán)重并發(fā)癥。最近有資料顯示雷帕霉素抑制邊緣供腎內(nèi)皮細(xì)胞的自身修復(fù)；抑制細(xì)胞增殖關(guān)鍵蛋白p70S6激酶的活化,影響受損腎小管上皮細(xì)胞的增生修復(fù)。這提示雷帕霉素抗增殖活性可能對組織自身修復(fù)造成影響。 肝臟外科領(lǐng)域中,手術(shù)操

2、作、肝臟移植、臟器保存、介入治療等都可能造成肝組織損傷。作為代償機(jī)制,肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞出現(xiàn)增生反應(yīng)。此時(shí)應(yīng)用雷帕霉素是否會(huì)抑制代償性增生、影響肝組織自身修復(fù),目前還不明確。本研究將探討雷帕霉素對膽管缺血后代償性增生的影響。 第一部分 雷帕霉素對膽管缺血后代償性增生的影響。 目的：觀察離斷大鼠膽管動(dòng)脈血供后,肝內(nèi)膽管代償性增生反應(yīng),探討雷帕霉素對于該反應(yīng)是否存在抑制作用。 方法： 雄性SD大鼠隨機(jī)分配到

3、：(1)缺血組(n=32);(2)缺血+雷帕霉素組(n=32);(3)假手術(shù)組(對照組,n=28);(4)假手術(shù)+雷帕霉素處理組(n=28)。缺血組完全離斷膽管動(dòng)脈血供,假手術(shù)組僅給予開關(guān)腹手術(shù),雷帕霉素處理組白手術(shù)當(dāng)日始每日給予雷帕霉素2.0mg/kg灌胃,非雷帕霉素處理組予生理鹽水2ml/kg灌胃。各實(shí)驗(yàn)組于術(shù)后第1、3、7天分別處死6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,術(shù)后14天處死全部動(dòng)物。取肝臟組織行H-E及Ki-67免疫組化染色。高倍鏡視野下,每只

4、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病理切片觀察15～20個(gè)匯管區(qū)。H-E切片分別計(jì)數(shù)每個(gè)匯管區(qū)內(nèi)小葉間膽管及匯管區(qū)周圍小膽管數(shù)目,分析單個(gè)匯管區(qū)內(nèi)小葉間膽管平均數(shù)目及單個(gè)匯管區(qū)周圍小膽管平均數(shù)目。Ki-67染色切片分別計(jì)數(shù)每個(gè)匯管區(qū)內(nèi)Ki-67陽性及陰性膽管細(xì)胞,計(jì)算陽性-陰性膽管細(xì)胞比值,分析單個(gè)匯管區(qū)內(nèi)Ki-67陽性-陰性膽管細(xì)胞平均比值。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件,結(jié)果以X±Sx表示,多個(gè)獨(dú)立樣本比較采用Kruskal-Wallis H

5、檢驗(yàn),多個(gè)獨(dú)立樣本間的兩兩比較采用秩轉(zhuǎn)換處理后行ONEWAY ANOVA檢驗(yàn),P<0.05時(shí)認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果： H-E染色切片顯示：對照組及假手術(shù)+雷帕霉素組術(shù)后未見明顯膽管增生,缺血組膽管增生明顯,既包括匯管區(qū)內(nèi)小葉間膽管增生,也包括匯管區(qū)周圍小膽管增生。匯管區(qū)內(nèi)小葉間膽管計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：與對照組比較,缺血組術(shù)后匯管區(qū)小葉間膽管數(shù)目明顯增加,術(shù)后2周內(nèi)與時(shí)間變化呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢,雷帕霉素處理膽管缺血大鼠后,小葉間

6、膽管數(shù)目增加幅度下降,術(shù)后7天、14天與缺血組間表現(xiàn)出顯著差異(P分別為0.034及0.026)。匯管區(qū)周圍小膽管計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：與對照組比較,缺血組術(shù)后匯管區(qū)周圍小膽管數(shù)目增加；給予雷帕霉素后,膽管缺血大鼠匯管區(qū)周圍小膽管數(shù)目增加幅度下降,術(shù)后1、7天與缺血組差異明顯(P分別為0.042及0.009)。Ki-67染色結(jié)果顯示：對照組及假手術(shù)+雷帕霉素組術(shù)后匯管區(qū)內(nèi)未見明顯Ki-67陽性染色膽管細(xì)胞,缺血組術(shù)后匯管區(qū)內(nèi)Ki-67陽性膽管細(xì)

7、胞明顯增多,但肝細(xì)胞染色無明顯增強(qiáng)。術(shù)后3天缺血組Ki-67陽性-陰性膽管細(xì)胞數(shù)目比值達(dá)到峰值,雷帕霉素處理后該峰值水平下降37.74％(P=0.002)。 結(jié)論：雷帕霉素抑制缺血后肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞Ki-67抗原表達(dá),明顯抑制匯管區(qū)內(nèi)小葉間膽管的代償性增生反應(yīng)；對于匯管區(qū)周圍小膽管的增生,雷帕霉素也具有一定抑制作用。 第二部分 雷帕霉素對肝功能及生存率的影響 目的：探討雷帕霉素對于實(shí)驗(yàn)大鼠膽管缺血后肝功能、體重及

8、生存率變化的影響。 方法： 雄性SD大鼠隨機(jī)分配到缺血組、缺血+雷帕霉素組、對照組及假手術(shù)+雷帕霉素組。缺血組完全離斷膽管動(dòng)脈血供,假手術(shù)組僅給予開關(guān)腹手術(shù),雷帕霉素處理組自手術(shù)當(dāng)日始每日予雷帕霉素2.0mg/kg灌胃,非雷帕霉素處理組予生理鹽水2ml/kg灌胃。術(shù)前、術(shù)后7天及14天測量動(dòng)物體重,計(jì)算術(shù)后7天、14天相對術(shù)前體重變化。各實(shí)驗(yàn)組于術(shù)后第1、3、7天分別處死6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,術(shù)后14天處死全部動(dòng)物,下腔靜脈抽血

9、2～3ml,檢測血清TBIL、ALP、GGT及ALT。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件,結(jié)果以X±Sx表示,多個(gè)獨(dú)立樣本比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),多個(gè)獨(dú)立樣本間的兩兩比較采用秩轉(zhuǎn)換處理后行ONE WAYANOVA檢驗(yàn),P<0.05時(shí)認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Kaplan-Meier分析生存率,組間生存差異采用log-rank檢驗(yàn),P<0.05時(shí)認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果： 與對照組比較,缺血組術(shù)

10、后血清TBIL升高明顯。雷帕霉素處理膽管缺血大鼠,術(shù)后7、14天血清TBIL水平顯著高于缺血組(P=0.005及0.003)。術(shù)后1～7天,缺血組ALP明顯升高,術(shù)后14天升高趨勢緩和。缺血+雷帕霉素組術(shù)后血清ALP持續(xù)升高,至術(shù)后14天仍保持上升趨勢,此時(shí)ALP水平明顯高于缺血組(P=0.012)。根據(jù)體重測量結(jié)果,缺血組術(shù)后體重下降明顯；給予雷帕霉素后,術(shù)后7、14天體重下降幅度增加(P<0.01)。Kaplan-Meier生存分析

11、結(jié)果顯示：缺血組生存率較對照組無明顯下降,但同時(shí)給予雷帕霉素后,生存率下降明顯(P<0.05)。 結(jié)論：雷帕霉素加重膽管缺血后肝內(nèi)膽汁淤積,影響肝功能恢復(fù),并對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后生存狀態(tài)及生存率造成影響。 第三部分 雷帕霉素對VEGF mRNA、p70S6激酶及磷酸化p70S6激酶的影響。 目的：探討雷帕霉素對實(shí)驗(yàn)大鼠膽管缺血后肝內(nèi)VEGF mRNA、p70S6激酶及磷酸化p70S6激酶含量的影響。 方法：

12、 雄性SD大鼠隨機(jī)分配到缺血組、缺血+雷帕霉素組、對照組(假手術(shù)組)以及假手術(shù)+雷帕霉素組。缺血組完全離斷膽管動(dòng)脈血供,假手術(shù)組僅給予開關(guān)腹手術(shù),雷帕霉素處理組白手術(shù)當(dāng)日始每日予雷帕霉素2.0mg/kg灌胃,非雷帕霉素處理組予生理鹽水2ml/kg灌胃。各實(shí)驗(yàn)組于術(shù)后第1、3、7天分別處死6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,術(shù)后14天處死全部動(dòng)物,取肝臟標(biāo)本于-80℃或10％中性甲醛中保存。免疫組化染色觀察肝內(nèi)VEGF表達(dá)情況,實(shí)時(shí)定量PCR檢測VEGF

13、mRNA水平,Western-blot檢測p70S6k及其磷酸化物的含量。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件,結(jié)果以X±Sx表示,多個(gè)獨(dú)立樣本比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn),多個(gè)獨(dú)立樣本間的兩兩比較采用秩轉(zhuǎn)換處理后行ONE WAY ANOVA檢驗(yàn),P<0.05時(shí)認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果： 免疫組化染色結(jié)果顯示：對照組及假手術(shù)+雷帕霉素組未見明顯VEGF陽性染色；缺血組及缺血+雷帕霉素組匯管區(qū)內(nèi)可

14、見VEGF陽性染色,主要定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示：缺血組VEGF mRNA升高明顯,術(shù)后3天達(dá)到峰值,為對照組7.57倍,術(shù)后1～14天,缺血組VEGF mRNA含量均明顯高于對照組(P<0.001)。用雷帕霉素處理膽管缺血大鼠,VEGF mRNA含量變化趨勢雖與缺血組相似,但峰值水平僅為缺血組54％(P=0.005);另外,術(shù)后1、7天缺血+雷帕霉素組VEGF mRNA含量明顯低于缺血組(P<0.05)。Wester

15、n-blot結(jié)果顯示,缺血組p70S6k表達(dá)上調(diào),其峰值水平為對照組的4.43倍(P<0.001);同時(shí),磷酸化p70S6k表達(dá)上調(diào),峰值水平為對照組9.64倍(P<0.01)。用雷帕霉素處理膽管缺血大鼠,術(shù)后p70S6k含量雖有增加,但是峰值水平僅為缺血組峰值50％(P=0.004);術(shù)后1、7、14天,缺血+雷帕霉素組p70S6k含量明顯低于缺血組(P<0.005)。用雷帕霉素處理膽管缺血大鼠,術(shù)后磷酸化p70S6k含量無增高趨勢；