微量雷帕霉素對缺血性腦損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：
　　 高血壓病在中國成人的發(fā)生率高達(dá)18％，目前我國約有2億高血壓病患者。腦卒中是高血壓最重要的并發(fā)癥之一，一旦發(fā)生病人非死即殘。預(yù)防和治療腦卒中已經(jīng)成為科學(xué)研究迫切需要解決的問題。目前對腦卒中的預(yù)防和治療，有藥物降壓、控血脂和抗凝等措施。但近年來腦卒中發(fā)生率仍呈持續(xù)上升趨勢，全球每年仍新發(fā)腦卒中1500萬，且日益年輕化。腦卒中發(fā)生的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，有必要進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究，找出更多的預(yù)防和治療藥物。

2、　　 雷帕霉素(Rapamycin，RAP)是20世紀(jì)70年代初由加拿大Ayerst研究所從放線菌培養(yǎng)液中分離出來的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，現(xiàn)在作為免疫抑制劑已在臨床上廣泛使用。作為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，目前研究發(fā)現(xiàn)RAP具有抗衰老和神經(jīng)營養(yǎng)等多種生物活性。既然有神經(jīng)保護(hù)活性，那么RAP對缺血性腦損傷有沒有保護(hù)作用?如果RAP有保護(hù)缺血性腦損傷的作用，那么確切機(jī)制是什么?因此，本課題主要針對這兩個問題進(jìn)行研究，以期發(fā)現(xiàn)RAP對缺血性腦損傷的保護(hù)

3、作用，并對其機(jī)制進(jìn)行初步探索。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法：
　　 實(shí)驗(yàn)一、RAP對易卒中自發(fā)性高血壓大鼠(SHR—SP)急性缺血性腦損傷影響：將50只3月齡雄性SHR—SPs隨機(jī)分為5組，分別給予溶媒二甲亞砜(DMSO)和RAP0．3、1．0、3．0、10μg/kg腹腔注射(i．p．)給藥3周后，進(jìn)行電凝法大腦中動脈阻塞(MCAO)手術(shù)，術(shù)后24小時取腦染色分析。
　　 實(shí)驗(yàn)二、RAP對C57小鼠急性缺血性腦損傷影響：將70只3月齡

4、雄性C57小鼠隨機(jī)分為7組，分別給予溶媒DMSO和RAP0．2、2、20、200μg/kg、2 mg/kg、20 mg/kg，連續(xù)i．p．給藥3周后，稱量體重，并進(jìn)行MCAO手術(shù)，術(shù)后24小時取腦染色分析。
　　 實(shí)驗(yàn)三、微量RAP長期給藥對SHR—SP壽命的影響：將30只3月齡雄性SHR—SPs隨機(jī)分為2組，分別飼喂微量RAP藥物飼料(3μg/kg/d)和普通飼料，記錄生存時間。
　　 實(shí)驗(yàn)四、RAP對神經(jīng)元細(xì)胞凋亡以

5、及腦皮層線粒體功能的影響。
　　 1、RAP對原代神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響：培養(yǎng)SHR—SP胎鼠(20—23天齡)的原代神經(jīng)元細(xì)胞，RAP給藥3小時后雙氧水(H2O2)或1—甲基—4—苯基吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)原代神經(jīng)元細(xì)胞凋亡造模，Hoechst法或四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定細(xì)胞的凋亡情況。
　　 2、RAP對腦皮層線粒體功能的影響：將9只3月齡雄性SHR—SPs隨機(jī)分為3組，分別給予RAP1μg/kg、1 mg/k

6、g和溶媒DMSO，連續(xù)i．p．給藥1周后取大腦皮層細(xì)胞，分別用Mitotracker GreenFM、JC—1和Dihydrorhodamine123染色后，流式細(xì)胞術(shù)檢測，觀察RAP對SHR—SP大腦皮層細(xì)胞的線粒體數(shù)量、膜勢能和活性氧(ROS)水平的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)五：研究微量RAP保護(hù)缺血性腦損傷的分子機(jī)制：
　　 1、蛋白質(zhì)磷酸化芯片：將2只雄性SHR—SPs分為2組分別給予RAP1μg/kg和溶媒DMSO，5

7、小時后取大腦皮層，做蛋白質(zhì)磷酸化芯片，尋找在RAP微量給藥時磷酸化水平有較大變化的蛋白。
　　 2、微量RAP對SHR—SP腦皮層mTOR蛋白磷酸化水平的影響：將9只雄性SHR—SPs隨機(jī)分為3組，分別給予RAP1μg/kg、1 mg/kg和溶媒DMSO5小時后，取大腦皮層，Western—blot方法檢測mTOR蛋白Ser2448位點(diǎn)磷酸化水平的變化。
　　 3、基因芯片和免疫共沉淀質(zhì)譜分析：將9只雄性SHR—SPs隨

8、機(jī)分為3組，分別給予RAP1μg/kg、1 mg/kg和溶媒DMSO，連續(xù)給藥1周后，取大腦皮層做基因芯片和免疫共沉淀質(zhì)譜分析，檢測大腦皮層細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激相關(guān)通路上蛋白的mRNA基因表達(dá)情況，尋找微量RAP給藥時與mTOR特異結(jié)合的下游蛋白。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、微量RAP(1—10μg/kg)預(yù)防性給藥能明顯減輕SHR—SP的腦梗死面積，對急性缺血性腦損傷有很好的保護(hù)作用。
　　 二、微量RAP(

9、0．2—20μg/kg)預(yù)防性給藥能明顯減輕C57小鼠的腦梗死面積，但當(dāng)給藥劑量增加至200μg/kg及以上時，RAP對急性缺血性腦損傷保護(hù)作用消失，反而使C57小鼠的體重減輕，狀態(tài)萎靡。
　　 三、微量RAP(3μg/kg)長期給藥能顯著地延緩SHR—SP腦卒中的發(fā)生，延長其壽命。
　　 四、RAP在一定濃度范圍內(nèi)能顯著減少氧化應(yīng)激造模和MPP+造模引起的原代神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。另外，微量RAP(1μg/kg)能顯著增加

10、SHR—SP的大腦皮層細(xì)胞的線粒體數(shù)量，增加線粒體的膜勢能，減少ROS的產(chǎn)生，1mg/1kg給藥劑量下的作用則不明顯。
　　 五、微量RAP保護(hù)缺血性腦損傷的分子機(jī)制
　　 1、蛋白質(zhì)芯片結(jié)果顯示：與對照組相比，微量RAP(1μg/kg)組，mTOR信號通路上，mTOR的上游蛋白AMPK、AKT、PDK1和下游蛋白S6K1和4EBP1的磷酸化水平均有明顯變化。
　　 2、Western—blot檢測發(fā)現(xiàn)：與對照組

11、相比，微量RAP(1μg/kg)組mTOR蛋白Ser2448位點(diǎn)的磷酸化水平明顯上調(diào)，RAP(1 mg/kg)組的作用不明顯。
　　 3、基因芯片結(jié)果顯示：微量RAP給藥一周后，SHR—SP的大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞在P53信號通路上，cyclinE基因表達(dá)上調(diào)，Gadd45基因表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1、微量RAP對急性缺血性腦損傷有很好的保護(hù)作用，長期給藥能顯著延緩SHR—SP腦卒中的發(fā)生，延長其壽命。