膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2在顱腦損傷中作用的研究及其基因重組蛋白制備.pdf

1、目的 明確膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(GGF2)在顱腦損傷恢復(fù)中的作用，探討顱腦損傷后GGF2轉(zhuǎn)基因治療的可行性，原核表達(dá)并純化GGF2重組蛋白。膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(glialgrowthfactor2，GGF2)是neuregulin基因的產(chǎn)物之一。GGF2與erbB受體家族成員的異二聚體或同二聚體結(jié)合，在發(fā)育及成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮廣泛而重要的生理作用。GGF2對(duì)于神經(jīng)元的發(fā)育、分布，膠質(zhì)細(xì)胞譜系的形成，突觸結(jié)構(gòu)的形成，神經(jīng)肌肉

2、接頭的形成等均起重要作用。體外研究發(fā)現(xiàn)GGF2可促進(jìn)神經(jīng)元的存活，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和存活，促進(jìn)雪旺氏細(xì)胞的增殖和分化。已發(fā)現(xiàn)GGF2對(duì)多種神經(jīng)系統(tǒng)病變的恢復(fù)有促進(jìn)作用，如多發(fā)性硬化、順鉑誘發(fā)的神經(jīng)功能障礙、坐骨神經(jīng)擠壓傷等。 該研究期望證明GGF2可促進(jìn)顱腦損傷的恢復(fù)，并探討GGF2轉(zhuǎn)基因治療顱腦損傷的可行性。該文還將通過原核表達(dá)的方法獲得GGF2重組蛋白，供將來進(jìn)一步研究之用。 第一部分 大鼠液壓腦損傷

3、模型中膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2及其受體mRNA的表達(dá)變化 目的 研究大鼠液壓腦損傷后GGF2及其受體erbB2、erbB3和erbB4mRNA在傷側(cè)皮層，海馬CA1、CA2、CA3區(qū)及齒狀回(DG)的表達(dá)變化規(guī)律。 方法 RT-PCR方法獲得總cDNA。設(shè)計(jì)四對(duì)特異性引物，分別針對(duì)GGF2mRNA全長(zhǎng)序列、erbB2、erbB3和erbB4mRNA序列中特異性片斷，PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增序列插入pBluescrip

4、tⅡSK(-)質(zhì)粒，構(gòu)建探針標(biāo)記用克隆。探針質(zhì)粒線形化后，利用T3RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄法獲得四種地高辛探針。Dotblot鑒定探針及明確探針滴度。成年SD大鼠隨機(jī)分為6組，側(cè)方液壓打擊(LFP)致傷，原位雜交方法分別研究打擊前，打擊后1h、6h、24h、72h、168h(7d)目的mRNA的表達(dá)情況，研究腦區(qū)包括傷側(cè)皮層、海馬CA1、CA2、CA3區(qū)及DG。 結(jié)果 經(jīng)測(cè)序鑒定成功構(gòu)建了四種探針克隆。成功標(biāo)記四種探針，并且

5、明確了探針滴度。大鼠LFP模型制作一致性好。原位雜交切片陽性信號(hào)強(qiáng)，背景弱，效果佳。雜交結(jié)果分析表明：在成年大鼠腦組織中，GGF2、erbB2、erbB3和erbB4mRNA均有表達(dá)，表達(dá)細(xì)胞均包括神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞。在給予LFP損傷后，目的mRNA在致傷后6小時(shí)均出現(xiàn)表達(dá)下降，在傷后1天，表達(dá)水平基本恢復(fù)至傷前水平。GGF2mRNA在傷后3天，在各腦區(qū)表達(dá)明顯增加，傷后7天表達(dá)水平稍有下降，但仍高于傷前。各受體mRNA在傷后3-7天表達(dá)

6、量在各腦區(qū)均無明顯變化。 結(jié)論 大鼠LFP致傷后3-7天，GGF2mRNA在傷側(cè)海馬CA1區(qū)、CA2區(qū)、CA3區(qū)、DG及皮層表達(dá)明顯增加，其受體mRNA表達(dá)量在傷側(cè)各腦區(qū)均無明顯變化。 第二部分 大鼠液壓腦損傷后陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)GGF2轉(zhuǎn)基因治療 目的 觀察大鼠LFP腦損傷后GGF2轉(zhuǎn)基因治療的效果，進(jìn)一步明確GGF2的神經(jīng)營養(yǎng)作用，探討顱腦損傷后基因治療的可行性。 方法

7、 PCR擴(kuò)增，得到GGF2基因全長(zhǎng)序列，插入pEGFP-N1載體，構(gòu)建pEGFP-N1-GGF2真核表達(dá)質(zhì)粒。以不同配比的陽離子脂質(zhì)體/質(zhì)粒混合物分別腦內(nèi)直接注射轉(zhuǎn)染LFP大鼠腦組織，明確最佳配比和轉(zhuǎn)染時(shí)相。大鼠完全隨機(jī)分為4組，分別為pEGFP-N1-GGF2+脂質(zhì)體治療組，空載體+脂質(zhì)體對(duì)照組，單純脂質(zhì)體對(duì)照組和假手術(shù)組。大鼠致傷后給予相應(yīng)治療，行為學(xué)測(cè)定觀察預(yù)后。觀察項(xiàng)目包括爬坡實(shí)驗(yàn)、平衡實(shí)驗(yàn)和行走實(shí)驗(yàn)，傷前測(cè)基礎(chǔ)值，傷后連續(xù)10

8、天測(cè)定。傷后第10天處死大鼠取標(biāo)本，行HE染色、尼氏染色及MBP、NSE、GFAP免疫組化染色。 結(jié)果 測(cè)序鑒定成功構(gòu)建pEGFP-N1-GGF2真核表達(dá)質(zhì)粒。明確了脂質(zhì)體：質(zhì)粒(μl：μg)為3：1時(shí)GGF2可獲最大表達(dá)量。表達(dá)從轉(zhuǎn)染后6h開始，3d后表達(dá)量達(dá)到最高，7d后仍高，14d時(shí)明顯下降。行為學(xué)測(cè)定表明pEGFP-N1-GGF2+脂質(zhì)體治療組預(yù)后優(yōu)于對(duì)照組，以行走實(shí)驗(yàn)改善最為明顯。組織學(xué)觀察表明治療組在傷側(cè)皮層

9、、海馬神經(jīng)元計(jì)數(shù)優(yōu)于對(duì)照組，傷側(cè)皮層、皮層下白質(zhì)MBP染色信號(hào)強(qiáng)度優(yōu)于對(duì)照組。 結(jié)論 GGF2在顱腦損傷后有神經(jīng)營養(yǎng)作用，陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法GGF2轉(zhuǎn)基因治療顱腦損傷有臨床應(yīng)用前途。 第三部分 GGF2的重組表達(dá)、純化 目的 通過原核表達(dá)的方法得到GGF2重組蛋白。 方法 亞克隆的方法將不含信號(hào)肽編碼序列的GGF2基因自PVT-GGF2質(zhì)?？寺≈罰CXJ18質(zhì)粒，再由PC

10、XJ18-GGF2質(zhì)粒克隆至PET-32(b)質(zhì)粒，構(gòu)建pET-32b(+)-GGF2表達(dá)載體。表達(dá)載體轉(zhuǎn)染四種宿主菌，篩選合適者。優(yōu)化表達(dá)時(shí)程和IPTG誘導(dǎo)劑量。GGF2大量表達(dá)后回收包涵體，復(fù)性。復(fù)性產(chǎn)物利用Ni·IDAHis·Bind樹脂進(jìn)一步純化。純化產(chǎn)物Westernblot鑒定。 結(jié)果 測(cè)序鑒定成功構(gòu)建pET-32b(+)-GGF2表達(dá)載體。篩選結(jié)果表明OrigamiB(DE3)為合適宿主菌。適宜的表達(dá)條件為