促紅細(xì)胞生成素對β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機制.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要的病理特征包括：以β-淀粉樣蛋白(β-amyloidprotein，Aβ)沉積為核心形成的老年斑(senileplaques，SPs)，以超磷酸化的Tau蛋白為核心形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangles，NFTs)及神經(jīng)細(xì)胞丟失等。在對AD發(fā)病機制的研究中，Aβ一直是研究中的熱點和焦點，大量的研究認(rèn)為，Aβ誘導(dǎo)的

2、神經(jīng)元凋亡及Tau蛋白磷酸化與AD的發(fā)病密切相關(guān)。因此，研究Aβ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及Tau蛋白磷酸化的作用機制對AD發(fā)病機制的研究具有重要的意義。促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，Epo)是一種可調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的細(xì)胞因子。然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Epo及其功能受體(Erythropoietinreceptor，Epo-R)在神經(jīng)系統(tǒng)中也有表達(dá)，且具有廣譜的神經(jīng)保護(hù)功能。Epo與其受體Epo-R結(jié)合后，可激活Jak2，對幾種下游信號

3、傳導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮其多種生理功能。PI3K是Jak2的下游靶激酶，參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、保護(hù)、學(xué)習(xí)和記憶等多種生理功能。Akt是PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一個下游靶激酶，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子。糖原合成激酶-3β(glycogensynthasekinase-3β，GSK-3β)是PI3K/Akt的下游底物，活化的Akt能誘導(dǎo)GSK-3β在絲氨酸Ser9位點的磷酸化，下調(diào)GSK-3β的活性，而GSK-3β與AD中Tau蛋白的磷酸化有

4、密切關(guān)系。近來研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的衰老，Epo在大鼠腦皮層和海馬的免疫反應(yīng)性逐漸下降，提示Epo免疫反應(yīng)性的下降可能與一些與衰老相關(guān)的神經(jīng)變性疾病，如AD等的發(fā)病有關(guān)。本研究采用凝聚態(tài)Aβ25-35作用于細(xì)胞，建立Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型，并用Epo進(jìn)行治療，觀察Epo對Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷特別是細(xì)胞凋亡及Tau蛋白磷酸化的影響，并明確其作用機制，旨在為AD的發(fā)病機制及治療探求新的途徑。本研究共分為以下四個部分： 第一部分

5、：Ap誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中P13K/Akt信號傳導(dǎo)通路的變化。首先采用MTT法檢測不同濃度的Aβ25-35作用24h后及20μmol/LAβ25-35作用不同時間后PC12細(xì)胞活力的變化；再采用AnnexinV-PI雙染色法觀察20μmol/LAβ25-35作用不同時間后細(xì)胞凋亡情況；采用Westernblotting法觀察p-Akt及p-GSK-3βSer9的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同濃度的(1、2、5、10、20、50μmol/L)Aβ25

6、-35作用24h后均可引起PC12細(xì)胞活力的下降(P＜0.05)，且隨著作用濃度的增加，該作用逐漸增強；20gmol/LAβ25-35作用不同時間(30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h)后均可引起PC12細(xì)胞活力的下降及細(xì)胞凋亡(P＜0.05)，且隨著作用時間的延長，該作用逐漸增強；Westernblotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35作用于細(xì)胞30min及1h后，p-Akt及p-GSK-3βSer9的表達(dá)均出現(xiàn)迅速的下

7、調(diào)(P＜0.05)，在作用3h時，p-Akt及p-GSK-3βSer9的表達(dá)均出現(xiàn)迅速的上升(P＜0.05)，在6h時又出現(xiàn)兩者的表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)；在12h時p-Akt表達(dá)又逐漸上升，但在48h時仍沒有達(dá)到正常水平；而p-GSK-3βSer9在Aβ25-35作用12h時表達(dá)出現(xiàn)了迅速的上升(P＜0.05)，而后逐漸恢復(fù)到正常水平。 第二部分：促紅細(xì)胞生成素對Aβ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。首先采用不同濃度的凝聚態(tài)Aβ25-3

8、5作用于PC12細(xì)胞24h后，觀察細(xì)胞活力的變化，進(jìn)而選擇出單一濃度的Aβ25-35誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，觀察Epo對Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，并選用P13K/Akt抑制劑LY294002研究其作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的Epo(5、10、20U)對20μmol/LAβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的下降均具有保護(hù)作用(P＜0.05)；Hoechst33258核染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20μmol/LAβ25-35作用細(xì)胞24h后細(xì)胞凋亡現(xiàn)象增加，不同濃

9、度的Epo(5、10、20U)對20μmol/LAβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡均具有保護(hù)作用(P＜0.05)；Westernblotting結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，20μmol/LAβ25-35作用細(xì)胞24h后，Bax/Bcl-2的比值明顯增加(P＜0.05)，Cleavedeaspase-3和CleavedPARP的表達(dá)也明顯增加(P＜0.05)；不同濃度的Epo(5、10、20U)對20μmol/LAβ25-35誘導(dǎo)的這些指標(biāo)的變化均具有抑制作用

10、(P＜0.05)；應(yīng)用PI3K/Akt抑制劑LY294002(50μmol/L)后，Epo對Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用消失了(P＜0.05)。 第三部分：Aβ誘導(dǎo)細(xì)胞Tau蛋白磷酸化。首先觀察20μmol/LAβ25-35作用于SH-SY5Y細(xì)胞不同時間點后，細(xì)胞Tau蛋白在Ser199，Ser396位點磷酸化水平及總Tau蛋白的表達(dá)；再選用GSK-3β抑制劑LiCL研究其作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20μmol/LAβ25

11、-35作用于細(xì)胞不同時間點后(0、30min、1h、3h、6h、12h、24h)，Tau蛋白在Ser199、Ser396位點的磷酸化水平在作用后3h逐漸增加(P＜0.05)，6h達(dá)到最高峰(P＜0.05)，12h后又逐漸下降(P＜0.05)，而Aβ25-35對總的Tau蛋白的表達(dá)的影響不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；GSK-3β抑制劑LiCL(20mmol/L)可抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的Ser396、Ser199位點的磷酸化(P＜0.

12、05)，提示GSK-3β參與了Aβ25-35誘導(dǎo)的Tau蛋白磷酸化的過程。我們又進(jìn)一步研究LiCL的作用機理發(fā)現(xiàn)，LiCL可通過誘導(dǎo)GSK-3β的失活形式p-GSK-3βSer9的表達(dá)增加從而抑制GSK-3β活性。 第四部分：Epo對Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞Tau蛋白磷酸化的影響。采用20μmol/LAβ25-35作用于SH-SY5Y細(xì)胞，觀察Epo對Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞Tau蛋白磷酸化的影響，并選用MAPK抑制劑PD98059及PI3K/Ak

13、t抑制劑LY294002研究其作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：20μmol/L的Aβ25-35可使Tau蛋白在Ser396、Ser199位點的磷酸化水平增高(P＜0.05)、p-Akt及p-GSK-3βSer9的表達(dá)降低(P＜0.05)；Epo可顯著抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的Tau蛋白在Ser396、Ser199位點的磷酸化水平增高(P＜0.05)，并可誘導(dǎo)p-Akt及p-GSK-3βSer9的表達(dá)增高(P＜0.05)；MAPK抑制劑PD98059(

14、50μmol/L)對Epo作用的影響不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；而P13K/Akt抑制劑LY294002(50μmol/L)在抑制p-Akt(P＜0.05)及p-GSK-3βSer9表達(dá)的同時，對Epo的作用也具有抑制作用(P＜0.05)。 本文的研究結(jié)果表明：1.Aβ25-35可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路參與了Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。2.Aβ25-35可誘導(dǎo)細(xì)胞Tau蛋白的磷酸化，GSK-3β參與了