傳染性法氏囊病毒粒子感染及其A節(jié)段編碼基因轉(zhuǎn)化細胞的轉(zhuǎn)錄本初步分析.pdf

1、傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)侵染雞法氏囊組織的B淋巴母細胞，導(dǎo)致嚴重的免疫抑制。為了探索IBDV感染及其編碼基因轉(zhuǎn)化對宿主細胞代謝的影響，本論文以Vero細胞為模型，利用LongSAGE技術(shù)(Long serial analysis of gene expression，LongSAGE)，對IBDV感染、A節(jié)段、VP2/4/3、VP5基因轉(zhuǎn)染的Vero細胞進行基因表達差

2、異分析，從不同角度挖掘病毒感染過程中，細胞基因表達的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，尋找病毒感染與細胞抗病毒過程中重要的基因及其相關(guān)通路。 (一)傳染性法氏囊病病毒A節(jié)段eDNA克隆 以傳染性法氏囊病病毒NB株(弱毒株)基因組dsRNA為模板，采用LA-PCR一步法擴增并克隆了IBDV基因組A節(jié)段全長cDNA。序列測定結(jié)果表明，IBDV基因組A節(jié)段全長共3,259個核苷酸，包括5’、3’-端的非編碼區(qū)(NCR)和兩個部分重疊的開放閱讀框(

3、ORF1和ORF2)，與GenBank中IBDV其他毒株同源性為81.8-99.9％，與JDl、Cu-1、P2、CEF94等毒株的關(guān)系最近，而與歐洲、香港、日本的超強毒株和美國的變異株相對較遠。其中ORF1編碼1012個氨基酸的多聚蛋白(VP2/4/3)與JD1同源性高達99.5％，VP2片段與JD1、CEF94和D78同源性為99.8％，VP3片段與JD1同源性99.2％，VP4片段與JD1同源性100％，VP5片段與JD1、HZ2、

4、P2、CEF94、CT、Cu-1和D78同源性99.3％。 (二)表達IBDV編碼基因的Vero克隆化細胞系構(gòu)建 將IBDV A節(jié)段、VP2/4/3、VP5、VP2、VP3等基因片段分別克隆入真核表達載體pEGFP-C2和pCI-neo，構(gòu)建了pEGFP-VP5、pEGFP-pVP2系列、pCI-neo-A、pCI-neo-VP2/4/3、pCI-neo-VP5、 pCI-neo-VP3、pCI-neo-pVP2系列等2

5、1種真核表達質(zhì)粒，在Lipofectamine 2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Vero細胞，利用熒光顯微鏡進行蛋白表達分析，結(jié)果顯示：pEGFP-VP5轉(zhuǎn)染Vero細胞后4-5h，能在細胞膜周圍觀察到與EGFP融合表達的VP5蛋白；pEGFP-pVP2系列蛋白在轉(zhuǎn)染后9-12h開始出現(xiàn)綠色熒光細胞。在此基礎(chǔ)上運用非融合表達的pCI-neo重組真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細胞，在G418抗性篩選下，進行表達IBDV A、VP2/4/3、VP5、VP2、v

6、P3細胞的克隆，通過PCR/Southern blot、RT-PCR/Northern blot、IFA/IPMA等鑒定，獲得了以下克隆化細胞系：獲得了2株A節(jié)段可穩(wěn)定表達其編碼蛋白VP2、VP4、VP3和VP5蛋白的克隆化細胞系；獲得了3株能穩(wěn)定表達VP2、VP4、VP3的含VP2/4/3基因克隆化Vero細胞；獲得了7株能穩(wěn)定表達IBDV VP5蛋白的克隆化細胞：獲得了17株能持續(xù)性表達不同VP2截短蛋白的克隆化細胞系；獲得了3株穩(wěn)

7、定表達VP3蛋白的克隆化細胞系。 (三)LongSAGE文庫構(gòu)建及數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用LongSAGE技術(shù)，分別從IBDV感染的Vero細胞、Vero-A+9C4細胞、Vero-VP2/4/3+4G8細胞、Vero-VP5+2F11細胞及正常Vero細胞中抽提mRNA，建立了5個LongSAGE文庫。驗證轉(zhuǎn)化效率與轉(zhuǎn)化子大小后，各文庫隨機選取2000個插入片段大于500bp的轉(zhuǎn)化子進行DNA測序分析。共獲得代表24475(占總

8、標簽數(shù)的25.44％)種不同轉(zhuǎn)錄本的96213個隨機標簽，3124種轉(zhuǎn)錄本能與在人類染色體上找到相應(yīng)位置(定位率為12.76％)。其中，從IBDV感染的Vero細胞庫中獲得代表9187種不同轉(zhuǎn)錄本的22193個標簽；從正常Vero細胞庫中獲得代表8369種不同轉(zhuǎn)錄本的17663個標簽；從Vero-VP5細胞庫中獲得代表7130種不同轉(zhuǎn)錄本的14221個標簽；從Vero-A細胞庫中獲得代表10160種不同轉(zhuǎn)錄本的22968個標簽；從Ver

9、o-VP2/4/3細胞庫中獲得代表8840種不同轉(zhuǎn)錄本的19168個標簽。 庫間轉(zhuǎn)錄本表達差異分析顯示：與正常的細胞相比較(P<0.05)，IBDV感染的細胞出現(xiàn)37種轉(zhuǎn)錄本表達上調(diào)、84種轉(zhuǎn)錄本表達下調(diào)，Vero-A細胞出現(xiàn)40種轉(zhuǎn)錄本表達上調(diào)、104種轉(zhuǎn)錄本表達下調(diào)，Vero-VP2/4/3細胞出現(xiàn)43種轉(zhuǎn)錄本表達上調(diào)、74種轉(zhuǎn)錄本表達下調(diào)，Vero-VP5細胞出現(xiàn)36種轉(zhuǎn)錄本表達上調(diào)、18種轉(zhuǎn)錄本表達下調(diào)。與IBDV感染細

10、胞相比(P<0.05)，Vero-A細胞(335種轉(zhuǎn)錄本)、Vero-VP2/4/3細胞(334種轉(zhuǎn)錄本)、Vero-VP5細胞(91種轉(zhuǎn)錄本)出現(xiàn)顯著水平的表達差異。與Vero-A細胞相比較，Vero-VP2/4/3細胞(49種轉(zhuǎn)錄本)、Vero-VP5細胞(113種轉(zhuǎn)錄本)出現(xiàn)表達水平的顯著差異。與Vero-VP2/4/3細胞相比較，Vero-VP5細胞(104種轉(zhuǎn)錄本)均出現(xiàn)表達水平的顯著差異。染色體定位結(jié)果顯示：在23條人類染色