AIP3B缺失重組體的構(gòu)建及其與Apoptin相互作用的研究.pdf

1、AIP3B（Apoptin Interaction Protein3B），又名CIA1A、FAM96A(family with sequence similarity96, member A),該基因定位于染色體上15q22.31，mRNA全長483個(gè)堿基，其編碼蛋白含有160個(gè)氨基酸，大小為18.4kd，鏈上有鋅離子結(jié)合位點(diǎn)，在體內(nèi)以單體和二聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。目前對(duì)AIP3B的研究報(bào)道較少，有報(bào)道表明AIP3B與CIAO1有相

2、互作用，可與CIAO1等形成大分子復(fù)合物，構(gòu)成鐵硫簇結(jié)合位點(diǎn)。另有學(xué)者認(rèn)為AIP3B在有絲分裂中可能通過穩(wěn)定姐妹染色體的結(jié)合來參與調(diào)控姐妹染色體的分離。
　　本課題組前期通過酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)AIP3B與Apoptin在細(xì)胞中存在相互作用，并在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中均證實(shí)了這一相互作用。該相互作用能夠影響Apoptin細(xì)胞核定位及其促凋亡活性。Apoptin是由雞貧血病毒（chicken anemia virus, CAV）編碼的非結(jié)構(gòu)

3、病毒蛋白，可以特異性誘導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的凋亡，卻對(duì)正常細(xì)胞沒有影響，而且它不依賴p53途徑產(chǎn)生誘導(dǎo)凋亡作用。Apoptin是一種胞質(zhì)、胞核穿梭蛋白，其定位決定于細(xì)胞給予何種定位信號(hào)。在對(duì)Apoptin的亞細(xì)胞定位檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，它在細(xì)胞內(nèi)的定位與其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)定位于細(xì)胞核且呈磷酸化狀態(tài)，磷酸化的Apoptin才有活性，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而在正常細(xì)胞內(nèi)則定位于細(xì)胞質(zhì)且呈非磷酸化狀態(tài)，無凋亡活性。因此，深入研究

4、AIP3B和Apoptin之間的相互作用具有重要生物學(xué)意義。
　　首先采用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建帶myc標(biāo)簽的AIP3B缺失重組的真核表達(dá)質(zhì)粒，分別為AIP3B△1（缺失的氨基酸序列為1-38）、AIP3B△2（缺失的氨基酸序列為39-119）、AIP3B△3（缺失的氨基酸序列為120-160），分別與pcDNA3.1-flag-Apoptin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，通過免疫共沉淀檢測(cè)AIP3B及其各個(gè)缺失重組

5、體是否與Apoptin在HEK293T細(xì)胞中發(fā)生相互作用。通過流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)AIP3B及其缺失重組體對(duì)Apoptin對(duì)HepG2細(xì)胞促凋亡活性的影響。
　　本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了三個(gè)AIP3B的缺失重組體。將其各自單獨(dú)轉(zhuǎn)染或與Apoptin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞中后，均可以成功表達(dá)。將AIP3B及其各個(gè)缺失重組體質(zhì)粒分別與Apoptin質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞中后提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀，結(jié)果表明全長的AIP3B、AIP

6、3B△1與Apoptin在HEK293T細(xì)胞中均存在相互作用，AIP3B△2和AIP3B△3與Apoptin在HEK293T細(xì)胞中不能相互作用。說明AIP3B△2和AIP3B△3缺失的區(qū)域可能是AIP3B與Apoptin直接相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列范圍為39-160，該區(qū)域在AIP3B與Apoptin相互作用的時(shí)候發(fā)揮重要功能，缺失該區(qū)域后AIP3B與Apoptin不能直接相互作用。將AIP3B及其各個(gè)缺失重組體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染