Hsp90β亞型對于GR信號通路的伴侶作用的研究.pdf

1、真核生物細(xì)胞中熱休克蛋白90(Hsp90s)作為關(guān)鍵的和廣泛存在的分子伴侶，對于一系列客戶蛋白的折疊、活化和組裝具有重要的作用，從而影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等過程。糖皮質(zhì)激素受體(GR)是非常重要的信號分子，與糖皮質(zhì)激素(GC)結(jié)合后引起廣泛的生理效應(yīng)和藥理效應(yīng)，對于許多生理過程如應(yīng)激、代謝、炎癥和免疫反應(yīng)具有不可缺少的調(diào)節(jié)作用。 GR是Hsp90的客戶蛋白之一，研究得較為深入，Hsp90對GR的作用過程可以代表性的

2、展示分子伴侶蛋白對信號分子的處理和作用方式。我們知道，Hsp90能夠改變GR的立體構(gòu)象，使GR的配體結(jié)合域象一個口袋一樣打開，從而能夠與糖皮質(zhì)激素結(jié)合。當(dāng)GC濃度增加，Hsp90從多種蛋白組成的GR復(fù)合體解離，使GC有機(jī)會進(jìn)入這。一口袋，得以與配體結(jié)合域結(jié)合。然后將會形成一個新的多蛋白復(fù)合體，包括GR,Hsp70,Hsp56和親免素。Hsp70和Hsp56將發(fā)揮對已活化的GR復(fù)合體的導(dǎo)向功能，使GR轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核內(nèi)，然后GR可以上調(diào)或者下

3、調(diào)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄從而得以發(fā)揮生理效應(yīng)。然而，有研究者指出，GR與GC結(jié)合后，仍然是在Hsp90的參與下并依賴于細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)才從胞漿向胞核運動。 胞漿中的Hsp90主要有兩種亞型，Hsp90ct(誘導(dǎo)型)和Hsp90p(組成型)。這兩種亞型的編碼基因位于不同的染色體。比對發(fā)現(xiàn)，同物種(如人或小鼠)的兩種亞型的堿基序列的同源性低于不同物種之間的(如人與小鼠之間)相同亞型的序列同源性。而且，Hsp90a和Hsp90p的表達(dá)與誘導(dǎo)模式都

4、不一致?？紤]到這些，我們設(shè)想Hsp90a和Hsp90p在發(fā)揮對GR信號通路的伴侶功能方面具有不同的作用。我們進(jìn)一步假設(shè)，Hsp90p亞型，而非Hsp90a亞型，才是使GR形成能結(jié)合GC的成熟構(gòu)象的關(guān)鍵分子。 眾所周知，不同的個體可能因為遺傳背景不一致而具有不同的糖皮質(zhì)激素敏感性。最近的研究指出，正常人群中6．6％的人對糖皮質(zhì)激素相對高敏，而2．3％的人對糖皮質(zhì)激素相對抵抗。盡管少數(shù)家系對GC抵抗的病例具有GR基因的多態(tài)性，許多病

5、例并沒有發(fā)現(xiàn)這種GR基因多態(tài)性。既然Hsp90在GR信號通路中扮演的角色極為關(guān)鍵，我們設(shè)想一些個體糖皮質(zhì)激素的敏感性不同源于Hsp90p基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。我們實驗室發(fā)現(xiàn)，遺傳背景相似的兩種小鼠，C57BL／6和BALB／c，在全身性沖擊傷和急性胰腺炎損害中，耐受潛能和死亡率不一致。我們發(fā)現(xiàn)這兩種品系小鼠的GR效應(yīng)是不一致的，GR核轉(zhuǎn)位能力不一樣，與染色質(zhì)的結(jié)合能力也不一樣，我們認(rèn)為GR效應(yīng)的差異至少是損傷耐受能力表型差異的

6、部分原因。所在實驗室已完成了對C57BL／6小鼠的Hsp84mRNA全長測序工作，當(dāng)和Genebank上面已提交的BALB／c小鼠的Hsp84mRNA序列比對時發(fā)現(xiàn)有四個堿基發(fā)生錯義突變，使Hsp84蛋白質(zhì)的4個氨基酸殘基發(fā)生替換。我們將進(jìn)一步檢查這一個假設(shè)：這兩種品系小鼠Hsp84存在著SNP，決定了GR效應(yīng)的差異，進(jìn)而影響炎癥和損傷耐受方面的表型差異。 一研究目標(biāo) 1．證明Hsp90a、Hsp90p(小鼠Hsp84、

7、Hsp86)對于GR形成并維持能結(jié)合GC的成熟構(gòu)象進(jìn)而與GC結(jié)合后從胞漿轉(zhuǎn)運到胞核等環(huán)節(jié)的作用有差異。 2．證明Hsp84基因多態(tài)性能夠影響GR的生物學(xué)效應(yīng)，即來源于C57BL／6小鼠和BALB／c小鼠的Hsp84在協(xié)助GR從細(xì)胞漿到細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的方面具有不同的效率,Hsp84基因多態(tài)性是遺傳背景高度同源的C57BL／6小鼠和BALB／c小鼠炎癥反應(yīng)程度差別顯著的重要原因。 二研究內(nèi)容和研究結(jié)果 1．將化學(xué)合成的三

8、段寡聚核苷酸與線性化的pSUPER-EGFP載體連接獲得了可用于沉默Hsp90p基因?qū)嶒灥娜齻€質(zhì)粒，測序驗證沉默質(zhì)粒構(gòu)建成功。我們先后用不同的脂質(zhì)體和質(zhì)粒比例轉(zhuǎn)染HUVEC、HepG2、HEK293三種細(xì)胞，以綠色熒光蛋白作為評價轉(zhuǎn)染效率的指標(biāo)，在HEK-293細(xì)胞中優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到80％左右。2通過RT-PCR的方法擴(kuò)增小鼠Hsp84基因，將其先后重組入pMDl8-T和pcDNA3．1載體，通過測序和雙酶切的方法表明載體

9、構(gòu)建正確，得到了可用于在真核細(xì)胞中表達(dá)Hsp84蛋白的重組質(zhì)粒pcDNA3．1一hsp84。 3用半定量PCR的方法，通過與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和未處理組比較發(fā)現(xiàn)：pSuper-Hsp9082轉(zhuǎn)染后18小時HEK-293細(xì)胞中Hsp90BmRNA水平明顯下降，而pcDNA3．1一hsp84轉(zhuǎn)染后18小時HEK-293細(xì)胞中Hsp90BmRNA水平明顯上升。 4GR結(jié)合GC后會從細(xì)胞漿向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞核中GR與細(xì)胞

10、漿中GR數(shù)量的比值會增大。免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，pcDNA3．1-Hsp84轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞24h后，與正常細(xì)胞組和pcDNA3．1組相比，GR核漿IOD相對值的比顯著升高。pSuper-Hsp9082轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后，與正常細(xì)胞組和pSuper—control組相比，GR核漿IOD相對值的比顯著下降。這提示Hsp90B是負(fù)責(zé)使GR構(gòu)象轉(zhuǎn)化的亞型。 5BALB／c小鼠來源的Hsp84mRNA通過RT-PCR，將全長編碼框插入p